摘　要　建立泌尿生殖系统沙眼衣原体感染阳性标本直接基因分型方法。先用敏感的扩增沙眼衣原体特异质粒

的引物扩增500份临床标本, 初筛选出100份阳性标本再用扩增沙眼衣原体主要外膜蛋白( MOM P)基因的引物扩

增, 并用嵌套式PC R使阳性标本能扩增出MOMP基因, 对获得的MOMP基因用限制性酶切片段长度多态性

( RFLP)方法进行基因分型,并用银染观察结果。其中E型比例最高,占47% ; F型为16% ; Da、G型均为6% ; Ba、D

型各占5% ; H型及K型均为1% ,混合型K /F型2% ; 混合型D / J、E /G均为1% ; 未能分型有9%

汪玎妍　郭辉玉　罗宪玲　蒋文玲　李质怀

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PCR /RFLP对临床标本沙眼衣原体直接基因分型①汪玎妍 1,②　郭辉玉 1　罗宪玲 2　蒋文玲 2　李质怀 2( 1　中山医科大学微生物学教研室 ; 广州 , 510089　 2　广东省老年医学研究所 ; 广州 , 510080)摘　要　建立泌尿生殖系统沙眼衣原体感染阳性标本直接基因分型方法。 先用敏感的扩增沙眼衣原体特异质粒的引物扩增 500份临床标本 ,初筛选出 100份阳性标本再用扩增沙眼衣原体主要外膜蛋白 ( M OM P)基因的引物扩增 ,并用嵌套式 PC R使阳性标本能扩增出 M OM P基因 ,对获得的 M OM P基因用限制性酶切片段长度多态性( RFLP)方法进行基因分型 ,并用银染观察结果。 其中 E型比例最高 ,占 47% ; F型为 16% ; Da、 G型均为 6% ; Ba、 D型各占 5% ; H型及 K型均为 1% ,混合型 K /F型 2% ;混合型 D /J、 E /G均为 1% ;未能分型有 9%。主题词　衣原体 ,沙眼 /遗传学 ; 基因型 ; 泌尿生殖系统疾病 /微生物学中图号　 R 371. 1　　衣原体是 8种严重危害人类健康的致病微生物之一 ,我国于 1989年由徐帆等人首次从子宫分离出沙眼衣原体 ,证实我国存在泌尿生殖道沙眼衣原体感染 ,之后有关泌尿生殖道沙眼衣原体感染的报道日渐增多 ,无论从普通人群或性乱人群均可发现有泌尿生殖道沙眼衣原体感染 [1, 2 ]。为了解我国人群沙眼衣原体泌尿生殖道感染的特点 ,为流行病学的追踪调查及变异株分布 ,以及预防诊断 ,设计疫苗提供理论及实验参考。 本研究建立了泌尿生殖系统沙眼衣原体感染直接基因分型方法 ,并直接对临床阳性标本作基因分型研究 ,报告如下。1　材料与方法1. 1　沙眼衣原体毒株沙眼衣原体标准毒株 A, B, Ba , D , E, F, L2来源于美国 A T CC,并用 Hep- 2细胞传代培养 [1, 2 ]。1. 2　临床标本从广州、佛山、深圳等地的性病专科门诊收集500份泌尿生殖道感染患者的标本 ,其中男性尿道拭子 100份 ,女性宫颈拭子标本 400份 ,这些患者年龄于 16～ 38岁之间 ,平均年龄 ( 23. 5岁± 25岁 )。1. 3　标本预处理所有标本采取后均存于含 1 mL PBS试管中 4℃贮存 , 24 h 内用旋涡器振荡后用毛吸管吸取悬液于1. 5 m L塑料离心管中 ,于 15 000 r /min离心 30 min,去上清 ,加入含h( T w een- 20) = 0. 5% , 15 mmol /LTris HCl ( p H8. 3 ) , 50 mmol /L K Cl, 1. 5 mmol /LM g Cl2 的细胞裂解液 50μL, 100℃ 10 min 后放 -70℃冰箱贮存。 或直接 15 000 r /min 5 min取上清5μL作 PCR反应。1. 4　 PCR检测沙眼衣原体特异质粒筛选阳性标本引物是根据沙眼原体特异的 7. 5 kbp的质粒DN A设计 [3, 4] ,上游引物 CHL1 5′T AG T AA CT GCCA CT T CA T -3′,下游引物 CHL2 5′-T CC CC TT GT A A T T CG T G C-3′。P CR反应总体积 20μL,内含 50 mmo l /L KCl, 1. 5 mo l /L M g Cl2 , 10 mmol /LTris HCl ( pH8. 3) , 0. 2 mmol /L dN T P, 25 pmol /L引物 , DN A模板用细胞裂解液上清 5μL,于 94℃变性5 min,置 72℃加 0. 5 U Ta q酶 ( Pro mega U SA) ,即用热启动以增加其扩增的特异性及敏感性 ,然后 94℃1 min, 50℃ 1 min, 72℃ 1 min, 35次循环的特异性及敏感性 ,然后 72℃延伸 5 min( P E公司 9600扩增仪中扩增 ) ,取 10μL PCR扩增产物于琼脂糖凝胶中电泳 , EB染色观察结果 ,扩增片段大小为 200 bp,同时作Souther n blo t,具体操作按德国宝灵曼公司 DN A地高辛 ( Dig oxig enin, D IG)标记试剂盒说明书进行。探针用PC R法制备 ,即用沙眼衣原体 L2血清型 DN A作模板 ,于含有 DIG-dU T P的 dN T P中作 PCR反应 ,其扩增产物用乙醇沉淀后用双蒸水溶解 ,于 94℃变性5 min后加入新配制的杂交液中 , D IG标记 DN A探针质量浓度为 25 mg /L。37中山医科大学学报 ( Acad J SUM S)1997, 18增刊∶ 37～ 40① 广东省卫生厅科研基金资助课题 ; ②　第一作者 , 1963年出生 ,女 ,助理研究员 ,博士研究生 ,现在广东省老年医学研究所工作 (广州 , 510080)DOI : 10. 13471 /j . cnki . j . sun. yat -sen. univ (med. sci ) . 1997. 01151. 5　沙眼衣原体 M O M P基因扩增 [3～ 5 ]根据沙眼衣原体 L3血清型的 M O M P基因( EM BL, 序列名为 C TM O M P1)设计引 物 C T-M O M P1 5’ -A T G A A A A A A C T C T T G A A AT CG-3’ (位于 1 - 21) , C TM O M P2 5’ -C T A A CTGT A ACT GO G T AT T-3’ (位于 1140- 1121)扩增产物为 1. 1 kbp的 M O M P基因片段。P CR反应总体积为 50μL, 含 10 mmo l / L T ris HCl ( p H8. 3 ) ,50 mmol /L KCl, 1. 75 m mol / L M g Cl2 , 0. 2 mmo l /LdN T P, 2. 5 pmo l / L引物 , DN A模板 5μL于 94℃变性 5 min于 72℃加入 T ag酶 1. 5 U , 94℃ 1 min,48℃ 1 min, 72℃ 2 min, 40循环后 72℃延伸 5 min( P E- 9600扩增仪中扩增 ) ,扩增产物用琼脂糖凝胶电泳 , EB染色 ,紫外灯观察扩增片段大小为 1.1 kbp。 同时作 Souther n blo t, DIG标记探针亦是用PCR制备。 对质粒 PCR阳性 ,而 M OM P基因 PCR阴性的标本采用另一套引物再次进行嵌套式 PCR的反应: CT M O M P3 T CC T GC A AG C T C C T G- 3’( 55- 72) , CT M OM P4 5’ - T T T C T A G A ( T /C)T T C A T T /C T T G- 3’ ( 1068- 1051) , PC R反应条件如上进行 , DN A模板取第一套引物的扩增产物2μL。1. 6　沙眼衣原体 M O M P基因的限制性酶切片段多态性 ( R FL P)分析基因分型的标准参照文献发表的 18种沙眼衣原体 M O M P基因限制性酶切片段多态性 RFL P图谱 [3, 5]。 具体采用 AluⅠ , HinfⅠ , DdeⅠ ,CfoⅠ 等限制性内切酶 ( Bochringer M annheim)取 M OM P PCR产物 10μL,加入 2. 5 U AluⅠ , 37℃酶解 1 h后于聚丙烯酰胺 50 m A电泳 2 h ,标准为 pBR 322 /HinfⅠ ,银染法观察结果 [6] ,即用 φ(乙醇 ) = 10%固定10 min,用 φ( HN O3 ) = 1%固定 3 min,然后用 w( Ag NO3 ) = 0. 2%染色 20 min,加入 dd H2 O漂洗5 min加入含φ(甲醛 ) = 0. 019%的 0. 28 mo l /L Na2CO3显色液 , 10～ 30 min,用φ(乙酸 ) = 10%终止反应 ,于日光灯箱下观察结果。2　结　果2. 1　 PCR扩增沙眼衣原体特异性质粒 DN A本实验用的引物 CHL1和 C HL2所限制的沙眼衣原体质粒 DN A片段碱基数为 200 bp,将沙眼衣原体 A, E, F, H, L2几种血清型的参考株接种细胞传代培养后 ,将其进行 10倍稀释 ,然后 15 000 r /min离心 30 min,取上清 ,加入细胞裂解液 50μL,于100℃作用 10 min,取上清 5μL作 PCR反应 ,结果显示能测 10～ 100 IFU /L (包涵体形成单位 / L, In-clusion body fo r ming unit IF U )衣原体 ,电泳后于M ar ke r 220 bp附近有清晰的电泳带 (图 1)。用正常细胞 ,肺炎衣原体 T W 183 ( W ashing ton Univ ersityResearch Fo undation U SA) ,鹦鹉热衣原体 B11001株 ,人巨细胞病毒 DN A, EB病毒 ,单纯疱疹病毒 ,肺炎支原体 ,解脲支原体 ,结核杆菌作为阴性对照则均呈阴性。扩增产物用 DIG标记探针检测也获同样结果。图 1　沙眼衣原体特异质粒 PCR结果扩增片段 200 bp, 1号为阳性对照 , 2、 3、 5、 6、 7、 8为临床标本扩增结果 , 7、 8为阳性标本 , 4号为片段长度标准 pBR 322 /HinfⅠ ; 221 /200bp是其第 6条带2. 2　 PCR扩增沙眼衣原体 M OM P基因本实验所用的 C TM O M P1 , CT M O M P2的引物扩增出 M O M P基因片段大小为 1. 1 kbp左右 ,将上述沙眼衣原体于细胞传代培养后 10倍稀释 ,结果显示 M OM P- PCR敏感性较质粒 PCR敏感性低 10倍 ,再用另一套引物 CT M OM P3 , C TM O M P4作嵌套式 PCR,可以将其敏感性提高到质粒 PCR水平 ,亦扩增出大小约 996 bp的产物 ,而且所设阴性对照均未扩增出 PCR产物。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳EB染色紫外灯下观察 (图 2)。同时亦用 D IG标记探针 , So uthe rn blo t杂交检测也获同样结果。图 2　沙眼衣原体 M O M P-PCR结果扩增片段为 1. 1 k bp, 1号为阳性对照 , 2、 3、 5、 6、 7、8为临床标本扩增结果 , 2、 3、 4为阳性标本 , 5号为片段长度标准 p BR322 /Hin fⅠ , 6、 7、 8为弱阳性标本38 中山医科大学学报 ( Acad J SUM S) 1997, 18增刊2. 3　沙眼衣原体基因分型从 500份临床标本筛选出 100份阳性标本均成功地扩增出 1. 1 kbp的 M OM P基因 ,接着用限制性酶切片段多态性及银染法对此 100份阳性标本进行基因分型 ,结果有 83份阳性标本 ( 83% )用 AluⅠRFL P分析即可以分出基因型。 E型比例最高占47% , F型居次为 16% ,然后是 G型占 6% , Ba型占5% , K型为 1% ; E / F, K / F混合各为 1% ,然后用EcoRⅠ 加 DdeⅠ 分出 H型及 D / J混合型占 1% ,用CfeⅠ 区别出 Da型占 6% ,有 9例由于图谱与 18种血清型标准图谱不一致 ,未能区别出来 ,需进一步序列分析 ,以确定其变异性 (表 1,图 3)。表 1　 100例泌尿生殖系衣原体 M OM P基因型分布基因型临床标本 M OM P基因型例数　 (% )男(n= 10)女(n= 90)总数(n= 100)Ba 　　　 　 5　 ( 5. 5) 　 5　 ( 5. 0)Da 1　 ( 10. 0) 5　 ( 5. 5) 6　 ( 6. 0)D 1　 ( 10. 0) 4　 ( 4. 4) 5　 ( 5. 0)E 6　 ( 60. 0) 41　 ( 45. 5) 47　 ( 47. 0)F 16　 ( 17. 7) 16　 ( 16. 0)G 6　 ( 6. 6) 6　 ( 6. 0)H 1　 ( 1. 1) 1　 ( 1. 0)K 1　 ( 1. 1) 1　 ( 1. 0)混合型D /J 1　 ( 1. 1) 1　 ( 1. 0)E /G 1　 ( 1. 1) 1　 ( 1. 0)K /G 2　 ( 2. 2) 2　 ( 2. 0)未能分型 2　 ( 20. 0) 7　 ( 7. 7) 9　 ( 9. 0)图 3　临床标本沙眼衣原体 M OM P-PCR RF L P直接基因分型银染结果第 1行为 PBR322 /Hin fⅠ ,第 2、 3、 4、 5、 6为临床标本 M OM P RFCP带谱 , 2、 3、 4行为变异图谱 ,与 18种标准血清型图谱不一致。 第 7行为血清型 E型阳性对照 ,可见第 5、 6号标本均为 E型3　讨　论本实验用敏感的扩增沙眼衣原体特异质粒的引物扩增泌尿生殖道感染患者的尿道拭子标本及宫颈拭子标本 ,将筛选出的阳性标本用扩增沙眼衣原体主要外膜蛋白基因的引物扩增 ,对 M O M P- PCR阴性标本用嵌套式 PCR,使之能扩增 M O M P基因片段 ,对获得的 1. 1 kbp的 M OM P基因片段用限制性酶切片段长度多态性 ( RFL P)的方法进行基因分型 ,并用银染法观察结果 ,使 100份阳性标本中 91例直接作基因分型 ,这种基因分型方法免去了选用细胞培养法分离培养鉴定沙眼衣原体 ,传代后纯化衣原体再用微量免疫荧光法对之进行血清分型等一系列繁琐步骤。 并且用银染法观察结果使敏感性大大提高 ,而且结果可保存 ,无致癌物污染。本研究临床阳性标本中 47%为基因 E型 , 16%为基因 F型 ,其次为 Da, G, Ba等占 5% ～ 6% ,还存有混合型 ,占 1% ～ 2% ,未能分型的占 9% ,提示本组沙眼衣原体泌尿生殖系统感染的基因型主要为E, F, Da, G等 ,与欧美等国家报道相符 [3, 5, 7, 8 ] ,国内宁波等 [9]用微量免疫荧光法对广州衣原体分离株进行血清分型 ,提示血清型 E型比例最高。然而尚存一定数目的变异型 ,需作进一步的序列分析 ,以确定其变异性 [10]。本实验室从 1991年起开始用 PCR法检测泌尿生殖系统沙眼衣原体感染 [11] ,开始用蛋白酶 K消化 ,酚抽提 ,乙醇沉淀以及用 N a I法抽提等。 最后确定用细胞裂解液 (如前所述 )于 100℃处理 10 min即能获满意结果。 由于确定了简便的标本处理方法及选择敏感性高的引物序列 ,使沙眼衣原体 M O M PPC R- R FL P的方法能直接用于大量标本的直接基因分型。 为了解我国人群沙眼衣原体泌尿生殖道感染的特点 ,为流行病学的追踪调查 ,以及衣原体主要外膜蛋白基因变异分析 ,设计有效的疫苗提供理论及实验参考。参 考 文 献1　汪玎妍 ,蒋文玲 ,李质怀 ,等 .细胞培养法检测泌尿生殖系沙眼衣原体感染 .中华皮肤病学杂志 ,1992, 25∶ 3692　汪玎妍 ,蒋文玲 ,李质怀 ,等 .沙眼衣原体感染的实验诊断方法的建立与应用 (摘要 ).中华微生物学与免疫学杂志 , 1992, 1∶ 3039增刊　汪玎妍 ,等 . PCR/ RFLP对临床标本沙眼衣原体直接基因分型3　 La n J, W abloo mers JM M , Ro osendaal R, et al .Dir ec t detectio n and geno typing o f chlamy dia tra-choma tis in cervical frag ment leng th polymo r-phism analysis. J Clin Micro bio l, 1993, 31∶ 10604　 Griffais R, T nibon M , Detectio n of chlamydiatrachoma tis. Res Micro biol, 1989, 140∶ 1395　 Fr ost EH, Desla ndes S, V eilleux S, et al. T ypingchlamydia tr acho matis by detectio n f rag mentleng th polymo rphism in the ge ne enco ding th ema jo r oute r membrane pro tein. J Infect Dis,1991, 163∶ 11036　 Her ring A J, Ing lis N F, O jen CK, et al . Rapid di-ag nosis o f r o tav irus infectio n by direct detectio no f vir al nucleic a cid in silv er stained polyacr y-lamid g els. J Clin Micr obio l, 1982, 16∶ 4737　 Fr ost EH, Desla nds S, Borg aux RD. Chlamydiatrachoma tis serov a rs in 435 ur og enital specimensby r estric tion endonuclease a na ly sis of amplifiedDN A. J Infect Dis, 1993, 168∶ 4978　 Lan J, Ing ebo rg M , Ch ris JL, et al. Pr ev alenceand ser ov ar distribution of asympto ma tic ce rv ica lchlam ydia tracho ma tis infectio n as deter mined byhig hly sensitiv e P CR. J Clin M icro biol, 1995, 33( 12)∶ 31949　宁　波 ,涂裕英 ,徐　帆 ,等 .广州地区性病沙眼衣原体分离株血清型分析 .中国人兽共患病杂志 , 1994, 3∶ 2310 Poo le E, La mont I. Chlamydia tracho matisserov a r differentia tio n by direct sequence analy -sis of the v ariable seg ment 4 r eg io n of th e ma jo ro uter membra ne pro tein g ene. Infect Immun,1992, 60( 3)∶ 108911汪玎妍 ,陈火胜 ,蒋文玲 ,等 . PCR检测沙眼衣原体及其质粒特异核酸 ,中华流行病学杂志 , 1992,13( 2)∶ 94( 1996-09-09收稿　 1996-12-06修回 )DIR ECT GENO TYP IN G OF CH L AM YD IA TRACH OM ATIS INCLIN ICAL SAM P LE S BY PCR-R FL P M E TH ODSWa ng Ding yan1　 Guo Huiyu1　 L uo Xia nling2　 Jia ng W enLing2　 Li Zhihuai2(1　 Department of M icrobiolog y, Sun Yat-sen University of M edical Sciences, Guangzhou , 5100892　 Guangdong Provincial Ins titute of Geriat ric M edicine, Guangzhou, 510080)Fiv e hundred clinical sa mples fro m uro genita l infection pa tients we re simply pretr eated by boiling fo r 10min and sc reened for chla mydia tra cho matis plasmid P CR. O ne hundred positive samples tested by plasmidPCR w er e subjected to PCR fo r Omp-1 g ene amplification, sev enty eight samples w er e fo und positiv e by directO mp-1 PCR while 22 direct O mp-1 neg ativ e samples beca me po sitiv e by the nested O mp-1 PCR. The ampli-fied O mp-1 g enes w ere tr ea ted with rest riction enzymes AluI, Hinf I, Dde I and Cfo I and the dig ested frag -ments w er e r un on po ly acry lamide g el with silv er staining. Geno types o f Chlamydia t rachoma tis in the 100clinica l samples wer e identified by analy sis o f their restrictio n fra gment leng th po ly mo rphisms. T he resultsshow ed that the g enoty pe E was the mo st pr ev alent types fo und in the urog enital infectio n pa tients in o urstudy , accounting fo r 47% ( 47 /100) and the nex t pr ev alence wa s the ge no type F 16% ( 16 /100) . Bo th g eno -ty pes Da and G made up 6% ( 6 /100) , bo th geno type Ba a nd D w ere 5% ( 5 /100) , a nd g eno ty pe H and K eachw as 1% ( 1 /100) . Mix ed ge no types K /F w er e fo und in 2% and mix ed g eno types D / J and E /G occurr ed in 1% .Nine sa mples w ere no t identifia ble because their R FL P patte rns did not cor respond to tha t o f any of the 18 C.T rachoma tis se rov ar s tested in this study.Su b j e c t h e ad in gs　　 chlamy dia tr acho matis /genetics; g eno type; uro g enital diseases /micro biolog y40 中山医科大学学报 ( Acad J SUM S) 1997, 18增刊

PCR/RFLP对临床标本沙眼衣原体直接基因分型

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