携带人胰岛素样生长因子-1重组腺病拆的构建和鉴定

Abstract

［目的 l 采用Cre-LoxP同源重组系统构建并鉴定携带人胰岛素样生长因子-1 (human insulin-like growth factor-I, hIGF-1)目的基因的复制缺陷重组腺病毒，为椎间盘退变的h!GF-1基因治疗奠定基础。［方法】 PCR合成h!GF-1基因，用pMD18-T载体克隆h!GF-1目的基因，酶切、测序并进行NCBI BLAST相似性在线分析。将pMD18-T- hIGF-1和pDNR-lr质粒分别行EcoR I和BamH I双酶切，DNA连接酶连接双酶切产物，转化感受态大肠杆菌DH5ct,合成中间载体pDNR-hIGF-1, 酶切鉴定。Cre-loxP系统介导pDNR-hIGF-1和pint. A VI. SpaT 同源重组形成pint. AVl. SpaT-hIGF-1重组表达质粒， 行EcoR I酶切鉴定。 复苏293细胞， 将 plnt. AVI. SpaT-hIGF-1和pint. B. B质粒在293细胞内进行同源赋组成含hlGF-1基因的复制缺陷重组腺病毒。 倒置显微镜观察293细胞病变样效应(cytopathogenic effect, CPE); 透射电镜观察293细胞中的病毒颗粒；提取细 胞裂解液中病毒DNA,PCR鉴定h!GF-1目的基因的存在；Western blot检测hIGF-1蛋白表达。用半数组织培养 感染鱼(tissue culture infectious dose 50, TCID,o)方法测定重组腺病毒的滴度。【结果】克隆的hIGF-1目的基因经 NCBI BLAST相似性在线分析证实与Homo sapiens IGF-1 (GI: 19923111)完全相同。pint. AVl. SpaT-hIGF-1酶切 鉴定，出现5. 4 kb和I kb两条片段，与理论值完全相符。转染293细胞12 - 14 d后，大部分细胞出现肿胀，脱落等细胞病变样效应。PCR鉴定细胞裂解液中含有h!GF-1目的基因。Western blot证实重组腺病毒表达hIGF-1蛋 白。第2代腺病毒的滴度为80 x 106 PFU/mL。［结论1 成功构建出含有h!GF-1目的基因的复制缺陷重组腺病 毒