目的: 用单一胚胎细胞进行人类种植前胚胎的性别鉴定。方法: 巢式 PCR 技术同时扩增单个活检细胞 Y 染色体上 的SRY 序列及位于 7 号染色体上的 ZP3 基因。结果: 卵裂期胚胎活检所得的 24个单细胞中 5个已变性,无 DNA 扩增,其余 19 个中 11个显示 SRY 和 ZP3 基因阳性,8 个显示 ZP3 基因阳性而 SRY 阴性。结论: 选择 SRY 和ZP3 基因引物对单个细胞进行巢 式 PCR 扩增是种植前胚胎性别鉴定的一种可靠的方法

李晓红　庄广伦　李　满

Directory of Open Access Journals

单细胞 PCR对种植前胚胎的性别鉴定①李晓红　庄广伦　李　满(中山医科大学附属第一医院生殖医学中心;广州 , 510080)摘　要　目的:用单一胚胎细胞进行人类种植前胚胎的性别鉴定。方法:巢式 PCR技术同时扩增单个活检细胞 Y染色体上的SRY序列及位于 7 号染色体上的 ZP3基因。结果:卵裂期胚胎活检所得的 24个单细胞中 5个已变性 ,无 DNA 扩增 ,其余 19个中 11个显示 SRY和 ZP3 基因阳性 , 8 个显示 ZP3 基因阳性而 SRY 阴性。结论:选择 SRY 和ZP3 基因引物对单个细胞进行巢式 PCR扩增是种植前胚胎性别鉴定的一种可靠的方法。主题词　聚合酶链反应/方法;胚胎/妇科学;性别预选中图号　R 711.6SEX DETERMINATION OF PREIMPLANTATIONEMBRYOS BY NEST PCRLi Xiaohong　Zhuang Guanglun　Li M an(Depar tment of Obstetric and Gynecology , First Affiliated Hospital ofSun Yat-sen University of Medical Sciences;Guangzhou , 510080)Abstract　Objective:To avoid the birth of a child w ith a harmful x-linked disease , we report sex determi-nat ion of preimplantat ion embryos by human testis-determining-gene amplif icat ion.Methods:Single embyo cellbiopsied f rom human polyspermic embryos w as amplified by nest polymerase chain react ion (PCR)with theSRY and control(ZP3)gene primers.Results:5 of 24 single embryo cells that is recognised at biopsy to have de-generated produced negative results.The other 11 of the embryo cells were positive for the SRY and ZP3 gene ,and 8 of the embryos were negative for the SRY gene and positive for the ZP3 gene.Conclusions:Selecting SRYand ZP3 gene primers can get accurate results in sex determination and is a reliable and precise method for rout inepreimplantation genet ic diagnosis.Subject headings　polymerase chain reaction/methods;embryo/embryology;sex preselection　　种植前遗传性疾病的诊断(Preimplantation ge-netic diagnosis , PGD)是伴随着单精子卵母细胞显微注射受精(Int racy toplasmic Sperm Injection , IC-SI)的第 2代试管婴儿技术结合分子生物学演进的新技术 ,它是对体外受精的胚胎在移植前取出部分卵裂球进行检测 ,经证实无遗传及代谢性疾病后再移植入子宫 , 在种植前阻止遗传病发生 。自Handyside 等[ 1]首次报告 PGD后妊娠至今已 6 年 ,PGD最常应用在 X性连锁遗传病。本文报道用巢式 PCR技术同时扩增单个活检细胞 Y染色体上的睾丸决定基因(SRY)及位于 7号染色体上的精子受体基因(ZP3),对有性连锁遗传高危的夫妇进行种植前胚胎的性别鉴定[ 2] 。1　材料与方法1.1　材　料1.1.1　全血 DNA 抽提　4例正常男性和 5 例正常女性的全血 DNA ,置低温备用 。1.1.2　淋巴细胞收集　以淋巴细胞分离液分离血中淋巴细胞 ,采用显微操作获得男性与女性单个淋巴细胞各 15个 。11中山医科大学学报(Acad J SUMS), 1998 , 19(1):11～ 13① 广东省科委科研基金资助课题DOI :10.13471/j.cnki.j.sun.yat -sen.univ(med.sci).1998.00041.1.3　胚胎细胞活检　24个多精受精胚胎在受精后第3天(4 ～ 8个细胞期)进行细胞活检。准备显微操作皿(1006.FALCON)后 ,将接受活检的卵裂期胚胎加入皿中微滴 ,然后将显微操作皿转送 37 ℃恒温的显微操作仪(Research Inst rument , UK)平台上 ,用显微固定针固定胚胎 ,用酸性的 Tyrodes 液在透明带上烧灼形成大小约 25 um 裂孔 , 然后以内径约20 μm的微穿刺针吸出单个卵裂球(图 1),将吸出的卵裂球移到 Eppendorf管中 ,置-20 ℃冷藏待用。图 1　胚胎细胞活检Fig.1　Embryo biopsy1.2　方　法检测单个细胞的 SRY基因引物序列来决定性别 ,用 ZP3 基因引物序列来作内对照。所有引物均由上海细胞生物所合成。1.2.1　全血DNA的 PCR扩增体系　PCR反应总体积 25 μL ,试剂包括 2 mmol/ L dNTP(Bohring-ma), 2.5 μL 10 ×PCR 缓冲液(包含 15 mmol/LM gCl)和 17.8 μL 的超纯水 。SRY 基因引物(5′-CATGAACGCATTCATCGTGTGGTC-3′;5′-CT-GCGGGAAGCAAACT-GCAATTCTT-3′;和 ZP3基因引物(5′-AGCCATCCTGAGACGTCCGTACA-3′;5′-CCTGACCACATCTTCTGT-GTCCAT-3′。)引物浓度为 0.05 μmol/L ,加 0.6 μL Taq 聚合酶(GIBCO)和 5 μL(1.5 μg)人血 DNA , 40 μL 矿物油覆盖 , 95 ℃变性 5 min ,随后在 Thermal Cycler(PE960)94 ℃, 60 ℃和 72 ℃60 s 30 循环 , 70 ℃10 min 。扩增的 DNA(15 μL)和分子量标准(CIB-CO)加到 2%琼脂糖凝胶电泳 , EB(Ethidium bro-mid)染色 ,紫外透光器下检查和拍照。1.2.2　单个淋巴细胞和单个胚胎细胞的 PCR扩增　配制总体积为 25 μL PCR 混合液 ,含 SRY 基因引物(5′-CAGTGTGAAACGGGAGAAAACAGT-3′;5′-GTT-GTCCAGT TGCACTTCGCTGCA-3′);和 ZP3 基 因 引 物 (5′-GTTGTCCAGTTG-CACTTCGCTGCA-3′;5′ACACTC-G TGGAGTCC-TACCTCAAA-3′)。将此混合液加到 0.5μL 含细胞样本 Eppendorf管中 ,95 ℃变性 5 min;随后 30个循环 , 94 ℃、60 ℃和 72 ℃60 s;70 ℃10min。制备别一批 PCR管 ,总体积 25 μL ,含巢式 SRY基因引物(5′-CATGAACGCATTCATCGTGT-GGTC-3′;5′-CTGCGGGAAGCAAACTGCAATTCTT-3′)和 ZP3 基 因 引 物 (5′-AGCCATCCTGA-GACGTCCGTCC-GTACA-3′; 5′-CCTGACCA-CATCT TCTGTGTCCAT-3′)。然后加入 1 μL第 1次PCR扩增的产物 ,再扩增30循环。扩增的DNA和分子量标准加到 2 %琼脂糖凝胶电泳 , EB 染色在紫外透照器下检查并拍照。2　结　果2.1　全血 DNA试验PCR扩增后 4个男性血 DNA 样本显示 SRY和 ZP3 基因阳性 ,而 5 个女性血 DNA 样本显示SRY基因阴性和ZP3基因阳性 。显示合成的 SRY和ZP3引物是合适的。2.2　单个淋巴细胞试验所有 15个来源于男性血的淋巴细胞 PCR扩增后 SRY和 ZP3 基因阳性;而所有 15个来源于女性血的淋巴细胞 SRY 基因阴性 , ZP3 基因阳性。结果提示该 PCR系统可以用于扩增单个细胞的基因片段。2.3　胚胎的性别鉴定24个卵裂球中 5个卵裂球经 PCR后不扩增 ,其它19个卵裂球都得到扩增产物。11个卵裂球显示SRY和ZP3基因阳性;8个显示SRY阴性而ZP3阳性(图2)。图 2　胚胎单细胞 PCR产物电泳Fig.2　Gel electrophoresis of DNA amplified from a single blas-tomere by nested polymerase chain reaction(PCR)M=molecular weight marker　m =male　f=female　177 bp=ZP3 gene　254 bp=SRY gene12 中山医科大学学报(Acad J SUMS), 1998 , 19(1)3　讨　论3.1　单细胞 PCR检测 SRY基因对 PGD的意义PGD对诊断的准确性和敏感性都要求很高 ,由于极其微量的初始 DNA 模板以及 DNA 结构上的不同 ,使其 DNA 扩增的 PCR反应条件与一般来源的 DNA的 PCR条件明显不同 。然而 ,用巢式引物检测单细胞单拷贝序列时 , PCR具有相当特异性和敏感性[ 3]。本试验所用巢式引物的靶 DNA 序列是人类 Y染色体上的 SRY 基因的主要序列 ,该基因的转录产物为睾丸特异性的 ,且一般认为它在男性睾丸发育过程中具有重要作用 。另有试验表明 ,PCR扩增检测睾丸决定基因具有种属特异性[ 4]。本试验单个淋巴细胞均得到满意的扩增 ,结果显示该法对扩增单个细胞是高效率和精确的 ,然而 24个卵裂球中有 5 个无 DNA扩增 ,可能与人胚含有一定比例的退化细胞有关。这点与国外文献报道结果一致[ 3] 。3.2　对照基因的应用可增加对诊断的准确性对照基因对于性连锁疾病的诊断是十分重要的 ,当单个细胞转送过程或 DNA 扩增过程失误时应用对照基因而不至于导致误诊。本试验选用了ZP3基因 ,该基因在女性会有表达 ,它的蛋白质在卵巢透明带作为精子的受体 ,而在男性则无表达 ,但对男性和女性底物均可提供极佳的 DNA 结果[ 5] 。另 1个避免误诊的方法就是用同 1 对初始引物对 X 和 Y 染色体上均有的同源序列进行扩增 ,然后根据扩增片段的大小不同来区分[ 6] 。3.3　单细胞 PCR的污染问题极端敏感的 PCR 应用到单细胞是极易污染的 ,由于试剂和外界环境物质所致的污染可通过认真的试验操作技术得以避免。对于可能包含的精子(粘附于透明带),颗粒细胞等可由对活检前的胚胎进行反复地清洗和多次更换吸管得到避免 。现在多采用 ICSI 后的胚胎进行活检 ,因而上述污染较少发生 。由于对性连锁遗传病携带者胚胎进行性别鉴定的目的是弃去 50%疾病的男胚 ,因此 ,若女性胚胎被男性细胞或 DNA污染 ,污染物也得到扩增 ,这胚胎就可能被诊为男性而不被移植入子宫;1个被女性 DNA 污染的女性胚胎可以被植入。被女性DNA污染的男性胚胎也同样不被植入 ,如果女性细胞或DNA污染了无卵裂球细胞或 DNA 的标本 ,而所活检的胚胎恰好是 1个受影响的男胚 ,将导致男胚误诊为女胚而被植入子宫 ,引起临床后果。因此要选用形态上具有最佳核型的细胞 ,以避免扩增失败。另外 ,增加若干个阳性 DNA 对照可大大减少这种罕有的现象。3.4　X 性连锁疾病的 PGD 最终是 DNA 突变检测 ,而不是性别鉴定目前已知大量常见的 X 性连锁疾病出现连锁标记或特殊变异 ,其致病基因就位于 X染色体上 ,因此 ,对有特殊疾病倾向的性连锁遗传病高危夫妇 ,测定胚胎性别仅是 1个初步措施。随着分子生物学的发展 ,大多数情况下进行种植前诊断时精确的 DNA突变检测将会取代目前的性别鉴定 。任何1种 PGD技术包括囊胚活检 ,由于受检 DNA 的含量问题 ,不可能似检测早孕绒毛样本那样可靠。追踪早孕绒毛样本等来确定诊断在 PGD 后列为常规。无论如何 , PGD作为 1 种遗传病筛选 ,减少遗传性疾病的发生应该是很有意义的 ,而巢式 PCR法为 PGD提供了敏感特异的有效手段。参 考 文 献1　Handyside AH , Kontogianni FH , Hardy K , et al.P reg-nancies from biopsied human preimplantation embryossexed by Y-specific DNA amplification.Nature, 1990 ,244:7682　Joyce C , Harper.Preimplantation diagnosis of inheriteddisease by embryo biopsy:an update of the w orld figures.J Assist Reprod Genet , 1996 , 13:903　Ke-hui Cui , Graham M W , Regan J , et al.Sex determi-nation of preimplantation embryo s by human testis-deter-mining-gene amplification.Lancet , 1994 , 343:794　Sinclair A H , Berta P , Palmer M S , et al.A gene fromthe human sex-determining region encodes a pro tein withhomology to a conserved DNA binding mo tif.Nature ,1990 , 345:2405　Van Duin M , Polman J , Suikerbuik RF , et al.The hu-man sperm receptor gene ZP3 is lo calized on chromosome7 , Cy togenet Cell Genet , 1991 , 58:19276　Findloy I , Quirke P , Hall J , et al.Fluorescent PCR:anew technique for PGD of sex and single-gene defects.JAssist Reprod Genet , 1996 , 13(2):96(1997-08-14 收稿　1997-11-14 修回)13第 1期　李晓红 ,等.单细胞 PCR对种植前胚胎的性别鉴定

单细胞 PCR 对种植前胚胎的性别鉴定

https://xuebaoyx.sysu.edu.cn/rc-pub/front/front-article/download/43589742/lowqualitypdf/单细胞 PCR 对种植前胚胎的性别鉴定.pdf

单细胞 PCR 对种植前胚胎的性别鉴定

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Directory of Open Access Journals