Die Produktion disufidhaltiger Proteine in ihrer nativen Form in Escherichia coli ist eine Herausforderung für die wissenschaftliche Forschung. Durch Sekretion solcher Proteine in das oxidierende Periplasma kann die Bildung der natürlichen Struktur erreicht werden. In der Untersuchung wurden humanes Pepsinogen und humanes Proinsulin als Modellproteine verwendet. Humanes Pepsinogen wurde an den C-Terminus von Ecotin, den E. coli trypsin inhibitor, fusioniert. Ecotin ist ein sehr stabiles homodimeres periplasmatisches Protein (16 kDa). Nach Fermentation und Produktion von Ecotin-Pepsinogen unter Kontrolle des trc-Promotors wurde das Fusionsprotein zur Homogenität aufgereinigt. Die Ausbeute für natives Pepsinogen betrug 7,6 mg pro L Fermentationsmedium. Für die Quantifizierung von Pepsinogen wurde ein neuartiges Fluoreszenz-Nachweissystem entwickelt, mit EGFP (enhanced green fluorescent protein) als Substrat. Die Eignung von Ecotin als Fusionspartner für die periplasmatische Proteinproduktion wurde mit humanem Proinsulin als weiterem Modellprotein überprüft. Proinsulin unterscheidet sich von Pepsinogen in Größe, Struktur, Muster der Disulfidverbrückung, und Funktion. Proinsulin wurde an den C-Terminus von Ecotin fusioniert und unter der Kontrolle des trc-Promotors in E. coli exprimiert. Nach Fermentation im Hochzelldichteverfahren wurden 153 mg Ecotin-Proinsulin pro Liter Fermentationsmedium produziert. Die Reinigung des Fusionsproteins erfolgte durch Aufarbeitung der Zellen mittels einer neu etablierten Affinitätschromatographie mit Trypsinogen als immobilisierten Bindungsmolekül.The production of proteins containing native disulfide bonds in Escherichia coli is a challenging task of research. Secretion of such proteins into the oxidizing periplasm of E. coli gives a chance of proper folding. In this study, human pepsinogen and human proinsulin were used as model proteins. As a new approach, human pepsinogen was fused to the C-terminus of ecotin, E. coli trypsin inhibitor, which is a highly stable homodimeric periplasmic protein (16 kDa). After production of ecotin-pepsinogen under control of a trc promoter, ecotin-pepsinogen was purified to homogeneity. The yield of purified native pepsinogen was 7.6 mg per liter fermentation broth. For the quantification of pepsinogen, a fluorogenic assay was developed using EGFP, enhanced green fluorescent protein, as a substrate. To evaluate the applicability of ecotin as a periplasmic fusion tag, human proinsulin was chosen as second model protein because it differs from pepsinogen in size, fold, pattern of disulfide bonds, and function. Proinsulin was fused to the C-terminus of ecotin and was expressed under control of the trc promoter. In high cell density cultivation, 153 mg ecotin-proinsulin per liter broth was produced. Downstream processing of ecotin-proinsulin was done in one step using a newly established affinity purification method based on the strong binding affinity of ecotin for trypsinogen.von Ajamaluddin Mali
