Development of methods for analyzing phthalate-type plasticizers and bile acids in biological matrices : applications in different pathophysiological contexts

Abstract

Ce travail de thèse s'articule autour de deux axes :1/ Les plastifiants, y compris les phtalates, ont été identifiés comme cancérigènes, mutagènes, reprotoxiques (CMR) de catégorie 1b et comme perturbateurs endocriniens. Le di-2-éthylhexyle phtalate (DEHP) est l'un des plastifiants les plus courants et est généralement associé au polychlorure de vinyle (PVC) dans les dispositifs médicaux. Le DEHP n'étant pas lié de manière covalente au PVC, il peut facilement migrer dans des matrices lipophiles et atteindre ensuite la circulation sanguine. Il est métabolisé par le foie en mono-2-éthylhexyle phtalate (MEHP), tout aussi toxique. Ces dernières années, des plastifiants alternatifs au DEHP ont été développés, notamment le di-2-éthylhexyl téréphtalate (DEHT), qui est métabolisé in vivo en mono-2-éthylhexyl téréphtalate (MEHT).La première partie de ce travail de thèse a consisté à développer des méthodes de dosage des plastifiants et de leurs métabolites dans diverses matrices biologiques, comme par exemple le plasma. Deux méthodes LC-MS/MS ont été développées pour la détermination du DEHP et du MEHP ainsi que des métabolites du DEHT. L'ionisation par spectrométrie de masse du DEHT étant très faible, une méthode LC-UV a été développée pour quantifier ce téréphtalate. Ces méthodes ont permis d'estimer le relargage du DEHP et du DEHT à partir de poches de sang et le dosage de leurs métabolites primaires dans les produits sanguins.2/ Les acides biliaires (AB) constituent une large famille de stéroïdes composée de nombreuses espèces. Ils sont synthétisés dans le foie et l'intestin et représentent la voie principale de catabolisme du cholestérol. Le 7a-hydroxy-4-cholesten-3-one (C4) est le précurseur des AB. Les AB jouent un rôle essentiel dans l'absorption des lipides mais également dans la signalisation cellulaire, étant ligands du récepteur nucléaire « Farnesoid X receptor » (FXR) et/ou du récepteur membranaire couplé aux protéines G, TGR5. Ces récepteurs, et donc leurs ligands, sont impliqués dans la régulation de l'homéostasie du glucose, des lipides et de la dépense énergétique. Toute modulation du profil des AB peut donc conduire à une modification de l'homéostasie métabolique.La deuxième partie de ce travail de thèse a consisté à développer deux méthodes de dosage par LC-MS/MS de 31 espèces d'AB et du C4 dans différentes matrices biologiques, dont le plasma. Une méthode spécifique permettant le dosage d'AB dérivés du LCA, récemment décrits, dans du contenu caecal est en cours d'optimisation. Ces méthodes ont permis d'analyser les variations du profil des AB dans divers contextes de la maladie cardiométabolique (obésité, insulino-résistance, diabète de type 2, NAFLD).Pour conclure, les méthodes d'analyse développées pour la quantification des plastifiants et des AB ont été validées et appliquées dans des études précliniques et cliniques. De manière intéressante, des données de la littérature ainsi que des essais préliminaires de transfection transitoire ont montré que des phtalates et leurs métabolites modulent l'activité du récepteur alpha activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPARa) régulateur clé de l'homéostasie métabolique et de l'expression de l'enzyme CYP7A1 (enzyme majeure de la synthèse hépatique des AB). Les outils analytiques développés dans cette thèse permettent d'ouvrir des perspectives originales d'étude des effets des phtalates sur l'homéostasie métabolique via la régulation du métabolisme des AB.L'ensemble de ces travaux a permis de lier développements analytiques et applications dans le domaine de la biologie et de la santé.This thesis has two main focuses:1/ Plasticizers, including phthalates, have been identified as category 1b carcinogenic, mutagenic and reprotoxic (CMR) and as endocrine disruptors. Di-2-ethylhexyl phthalate (DEHP) is one of the most common plasticizers and is generally associated with polyvinyl chloride (PVC) in medical devices. As DEHP is not covalently bound to PVC, it can easily migrate into lipophilic matrices and then reach the bloodstream. It is metabolized by the liver into mono-2-ethylhexyl phthalate (MEHP), which is just as toxic. In recent years, alternative plasticizers to DEHP have been developed, notably di-2-ethylhexyl terephthalate (DEHT), which is metabolized in vivo to mono-2-ethylhexyl terephthalate (MEHT).The first part of this thesis involved developing methods for measuring plasticizers and their metabolites in various biological matrices, such as plasma. Two LC-MS/MS methods were developed for the determination of DEHP and MEHP as well as DEHT metabolites. As the ionization in mass spectrometry of DEHT is very low, a LC-UV method was developed to quantify this terephthalate. These methods have made it possible to estimate the release of DEHP and DEHT from blood bags and to measure their primary metabolites in blood products.2/ Bile acids (BA) are a large family of steroids made up of numerous species. They are synthesized in the liver and intestine and represent the main route of cholesterol catabolism. 7a-hydroxy-4-cholesten-3-one (C4) is the precursor of BA. BA play an essential role in lipid absorption but also in cell signaling, as they are ligands for the nuclear receptor 'Farnesoid X receptor' (FXR) and/or the G protein-coupled membrane receptor, TGR5. These receptors, and hence their ligands, are involved in glucose homeostasis, lipid homeostasis and energy expenditure. Any modulation of the BA profile can therefore lead to changes in metabolic homeostasis. The second part of this thesis involved developing two LC-MS/MS assay methods for 31 BA species and C4 in different biological matrices, including plasma. A specific method for the determination of recently described BA derived from LCA in caecal contents is currently being optimized. These methods have made it possible to analyze variations in the BA profile in various cardiometabolic disease contexts (obesity, insulin resistance, type 2 diabetes, NAFLD).In conclusion, the analytical methods developed for quantifying plasticizers and BA have been validated and applied in preclinical and clinical studies. Interestingly, data from the literature and preliminary transient transfection assays have shown that phthalates and their metabolites modulate the activity of the peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARa), a key regulator of metabolic homeostasis and expression of CYP7A1 (a major enzyme in hepatic BA synthesis). The analytical tools developed in this thesis open up original perspectives for studying the effects of phthalates on metabolic homeostasis via the regulation of BA metabolism. All of this work has made it possible to link analytical developments and applications in the field of biology and health