Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Abstract
Las proteínas de la familia CRISP1-4 (Cysteine-RichSecretoryProteins) se expresan tanto en el tracto reproductor de mamíferos donde actúan como mediadores del proceso de fertilización, como en órganos de importancia inmunológica. En base a ello, el objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido investigar la relevancia de las CRISP como reguladores tanto de la fertilidad como del sistema inmune a través del empleo de animales simples y múltiples knockout (KO) para las CRISP. Teniendo en cuenta resultados previos de nuestro laboratorio indicando que la proteína CRISP1 exhibe la capacidad de inhibir a CatSper, el principal canal de calcio del espermatozoide esencial para la fertilidad masculina, como primer objetivo nos planteamos continuar investigando la actividad de CRISP1 como regulador de CatSper y explorar su posible empleo para el desarrollo de un método anticonceptivo masculino. Los resultados revelaron que la exposición de espermatozoides a HC-056456 (HC), un compuesto que inhibe la actividad de CatSper tal como CRISP1, fue capaz de inhibir la capacidad fertilizante de los espermatozoides tanto in vitro como in vivo, apoyando la posibilidad de desarrollar un método anticonceptivo masculino basado en la actividad inhibitoria de CRISP1 sobre CatSper. La normal fertilidad de los machos simples KO para las proteínas CRISP1, CRISP2 y CRISP4 generados en nuestro laboratorio, junto a la observada subfertilidad de los machos carentes de dos proteínas CRISP (CRISP1 y CRISP4) simultáneamente, apoyan la existencia de mecanismos de compensación entre los diferentes miembros de la familia CRISP. En base a ello, y considerando la no disponibilidad del ratón simple KO para la proteína CRISP3, el segundo objetivo de esta Tesis consistió en el desarrollo y caracterización tanto del animal simple KO para CRISP3 como de animales múltiples KO para diferentes CRISP a través del empleo de la técnica CRISPR/Cas9. Los resultados revelaron que la presencia de la mutación en el gen Crisp3 afectó la expresión de CRISP1, llevando a la generación de un animal doble KO (DKO) para CRISP1 y CRISP3. La caracterización de estos animales a nivel reproductivo mostró una bajada significativa de la fertilidad tanto en los machos como en las hembras, representando ésta la primera evidencia de la relevancia de las CRISP para la fertilidad femenina. Más aun, observamos que la subfertilidad de esta colonia se debería, principalmente, a defectos en el desarrollo temprano de los embriones, revelando por primera vez el rol de las CRISP en eventos posteriores a la fertilización. Los animales carentes de más de dos proteínas CRISP simultáneamente se generaron empleando una construcción capaz de interferir con los genes Crisp1 y Crisp3 en animales fértiles DKO CRISP2/CRISP4 disponibles en el laboratorio. El estudio de la fertilidad de los animales triples (TKO) y cuádruples (CKO) KO generados reveló que los machos eran prácticamente infértiles a juzgar por un promedio de crías por camada inferior a 1. El análisis de los mecanismos subyacentes a este fenotipo reveló defectos en la migración por el tracto femenino y capacidad fertilizante de los espermatozoides como así también en el desarrollo embrionario temprano, indicando que la severa bajada de la fertilidad sería la resultante de una combinación de defectos a diferentes niveles. Finalmente, en base a observaciones previas de nuestro grupo indicando la presencia de CRISP1 y CRISP3 en células dendríticas (CD), investigamos el posible rol inmunoregulador de las CRISP utilizando animales simples y DKO para estas proteínas. Los resultados mostraron que la ausencia de CRISP1 y CRISP3 modifico la expresión de citoquinas de las CD y produjo un aumento en el porcentaje de Linfocitos T regulatorios en un co-cultivo de ambas células, favoreciendo una respuesta inmune de perfil tolerogénico. Consistente con ello, la inyección de células tumorales MA-10 en los animales simple KO y DKO condujo a un mayor crecimiento tumoral in vivo comparado con los controles, apoyando el rol de las CRISP en la regulación del sistema inmune. En conjunto, consideramos que estos resultados contribuirán a una mayor comprensión de los mecanismos involucrados en la regulación de la fertilidad y del sistema inmune, abriendo la posibilidad de que las CRISP sean empleadas en el futuro como agentes diagnósticos y/o targets terapéuticos.The Cysteine-Rich Secretory Proteins (CRISP1-4) are mainly expressed in the mammalian male reproductive tract where they act as mediators of the fertilization process as well as in organs of immunological importance. Based on this, the main aim of this Thesis has been to study the relevance of CRISP as possible regulators of fertility and the immune system through the use of simple and multiple knockout (KO) animals for these proteins. Based on previous results from our laboratory indicating that mouse CRISP1 protein exhibits the ability to inhibit CatSper, the main sperm calcium channel essential for male fertility, the first aim was to continue studying the role of CRISP1 as a CatSper regulator and to explore the possibility of its use for male contraceptive development. Results revealed that exposure of sperm to HC-056456 (HC), a drug that inhibits CatSper activity as CRISP1, was capable of inhibiting the sperm fertilizing ability in vitro as well as in vivo, supporting the possibility of developing a male contraceptive method based on the inhibitory activity of CRISP1 on CatSper channel. The normal fertility of single KO males for CRISP1, CRISP2 and CRISP4 generated by our group together with the subfertility observed in males lacking two CRISP proteins (CRISP1 and CRISP4) simultaneously, supports the existence of compensatory mechanisms among different CRISP family members. Based on this, and considering the unavailability of the single KO animal for CRISP3, the second objective of this work has been the generation and characterization of the single KO for CRISP3 as well as of multiple KO for different CRISP using the CRISPR/Cas9 technique. Results revealed that the mutation in Crisp3 affected the expression of CRISP1, leading to the generation of a double KO animal (DKO) for CRISP1 and CRISP3. The reproductive characterization of these DKO mice showed a significant decrease in fertility of both males and females, representing the first evidence of the relevance of CRISP proteins for female fertility. Moreover, we observed that the subfertility of this colony could be mainly due to defects in early embryo development, revealing for the first time the role of CRISP proteins in post-fertilization events. The animals lacking more than two CRISP simultaneously were generated through the introduction of a construct capable of interfering with Crisp1 and Crisp3 genes in fertile DKO CRISP2/CRISP4 animals already available in our laboratory. Evaluation of fertility of the generated triple (TKO) and quadruple (QKO) KO mice revealed that the males were almost infertile as judged by an average litter size of less than one. Analysis of the mechanisms underlying this phenotype revealed severe defects in sperm migration through the female tract and sperm fertilizing ability as well as on early embryonic development, indicating that the severe decrease in male fertility would be the result of a combination of defects at different levels. Finally, based on previous observations of our group indicating the presence of CRISP1 and CRISP3 in dendritic cells (CD), we investigated the possible immunoregulatory role of CRISP using both single KO and DKO mice for these proteins. Results revealed that the absence of CRISP1 and CRISP3 modified the cytokine expression profile of the CD and produced an increase in the percentage of regulatory T lymphocytes in a co-culture of both cells, favoring a tolerogenic type immune response. Consistent with this, injection of MA-10 tumor cells in KO and DKO animals led to a greater in vivo tumor growth compared to controls, supporting the role of CRISP as regulators of the immune system. Altogether, we believe these results will contribute to a better understanding of the mechanisms involved in the regulation of fertility and the immune system, opening the possibility of using CRISP in the future as diagnostic agents and / or therapeutic targets.Fil: Curci, Ludmila. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
