BUSO, G. S. C.

BUSO, J. A.

FERREIRA, M. E.

RITSCHEL, P. S.

Portuguese

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DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES MICROSSATÉLITES (SSR) PARA MELÃO (Cucumismelo)Suporte Financeiro: Programa Avança BrasilRitschel, P.S.1, Buso, G. S. C.2, Buso, J.A3 e Ferreira, M.E41Eng. Agr., Doutoranda, UnB / Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia2Eng. Agr., PhD, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia3Eng. Agr., PhD, Embrapa Hortaliças4Eng. Agr., PhD, Universidade Católica de BrasíliaA produção mundial  de melão vem apresentando uma tendência ao crescimento,  nos últimosanos. Em 1996, foram produzidas cerca de 16.000.000 toneladas de melão em nível mundial,sendo os maiores produtores a China, o Irã, a Turquia, a Espanha e os Estados Unidos. No Brasil,o  cultivo  do  melão,  principalmente  do  tipo  Amarelo,  vem  crescendo  nos  últimos  anos,especialmente  no  semi-árido  nordestino,  apresentando  um crescimento  estimado  em 58% noperíodo compreendido entre 1987 e 1991, devido tanto a um aumento na área cultivada (48%),quanto ao aumento da produtividade (cerca de 27%). Entretanto, a posição brasileira no cenáriomundial ainda é tímida, respondendo por apenas 1,5% da produção de melão.Uma das formas de aumentar a competitividade do produto brasileiro no mercado internacional eao  mesmo tempo incrementar  o  consumo interno  desta  olerícola  é  através  do  melhoramentogenético  da qualidade do fruto,  especialmente  no que diz  respeito  ao conteúdo de açúcares,expresso como teor de sólidos solúveis (graus-brix) da polpa do fruto. Um dos exemplos mais bemsucedidos do melhoramento genético do teor de sólidos solúveis e da qualidade do fruto é o dacultura  do  tomate.  Através  da  utilização  da  metodologia  de  linhagens  retrocruzadas  eautofecundadas (backcrossed inbred lines ou BILs) aliada ao uso de marcadores moleculares,foram identificados marcadores moleculares ligados a segmentos cromossômicos que influenciamo teor  de  sólidos  solúveis  em tomate  (Tanksley,  S.D.  &  Nelson,  J.C.  Theoretical  and  appliedGenetics v.92, p. 191-203, 1996). Um tipo de trabalho semelhante pode ser conduzido na culturade melão, com objetivo de não só de incrementar o teor de sólidos solúveis, mas também demelhorar  outras  caracteres  quantitativos  de  interesse,  relacionados  com a  qualidade  do  fruto(formato, firmeza, espessura da polpa) ou ainda com a produtividade ou a resistência a doenças.O  desenvolvimento  de  tecnologias  de  análise  genômica  na  cultura  do  melão  ainda  é  muitoincipiente. Existem vários trabalhos envolvendo marcadores RFLP, AFLP e RAPD, mas apenasseis marcadores microssatélites estão descritos para melão na literatura (Katzir et al., Theoreticaland Applied genetics v.93, p.1282-1290, 1996).Marcadores microssatélites ou SSR (Seqüências Simples Repetitivas) são ideais para aplicaçõesem Melhoramento de Plantas por sua natureza co-dominante, alto polimorfismo, riqueza em alelos,alta heterozigosidade e conteúdo informativo. Seqüências repetitivas são formadas por famílias derepetições em "tandem" contendo dois, três, quatro e até seis nucleotídeos (do tipo ATAT...). Aenorme variação observada nestas frações repetitivas do genoma, causada por  diferenças nonúmero de repetições do "motif", reforça a idéia de que estas seqüências não têm efeito sobre ofenótipo  e,  consequentemente  de  que  não  existe  pressão  seletiva  sobre  as  mesmas,  o  queaumentou  o  interesse  em  sua  utilização  como  marcadores  moleculares.  Seqüênciasmicrossatélites  estão  distribuídas  por  todo  o  genoma  e  o  seqüenciamento  de  suas  regiõesflanqueadoras, visando o desenho de primers específicos, possibilitou sua amplificação por PCR.O uso  deste  tipo  de  seqüência  como  marcadores  moleculares  foi  inicialmente  proposto  paraaplicações em genética humana, mas sua aplicação em outros organismos logo foi estabelecida.Pouquíssimos marcadores deste tipo estão disponíveis  para a cultura do melão (Katzir  et  al.,1996). Desta forma, a primeira etapa de um trabalho de melhoramento assistido por marcadoresmoleculares em melão, tendo como principal meta o aumento do teor de sólidos solúveis do fruto,Firefox https://mail-attachment.googleusercontent.com/attachment/u/0/?ui=2&i...1 of 5 09/04/2024, 15:35é o desenvolvimento de um número suficiente de marcadores SSR, que possibilite a construção deum mapa genético de alta densidade.Em  linhas  gerais,  o  desenvolvimento  de  marcadores  microssatélites  pode  ser  resumido  nosseguintes passos (Rafalski et al. Genomic Analysis: A pratical guide. Academic Press Inc.,1996. p.73-134):• Construção de uma biblioteca genômica de DNA.• Avaliação da Biblioteca por hibridização com segmentos de sequências repetidas visandoselecionar clones que apresentem estas sequências.• Confirmação da seqüência de DNA dos clones positivos, com a utilização deseqüenciamento de DNA.• Desenho de primers específicos para amplificação das sequências repetidas (marcadoresSSR).Construção e Enriquecimento de Bibliotecas genômicasO DNA genômico foi  extraído a partir  de folhas de plântulas do híbrido de melão AF686. Emseguida, foi realizado um teste de digestão enzimática, com o objetivo de selecionar enzimas derestrição que gerassem fragmentos de tamanho adequado, entre 300 e 800 pb. As enzimas Mse Ie Tsp 509 I foram escolhidas para a construção das Bibliotecas Genômicas. O DNA de melão foientão  digerido  com as  enzimas  de  restrição  selecionadas.  O  resultado  de  cada  digestão  foiseparado  em gel  de  agarose  3,5% e  os  fragmentos  de  tamanho  entre  300  e  800  bp  foramrecuperados em membrana DEAE-celulose NA-45. Os fragmentos selecionados foram purificadose ligados a adaptadores contendo sítios de restrição complementares à respectiva enzima derestrição. O enriquecimento das Bibliotecas para seqüências microssatélites foi realizado atravésda hibridização com oligonucleotídeos biotinilados. Grupos de fragmentos resultantes da digestãocom Mse foram hibridizados apenas com sondas (AG)13, enquanto os fragmentos originados dadigestão com Tsp foram hibridizados com sondas (AC)13 ou (AG)13. Os fragmentos selecionadosforam recuperados  com a  utilização  de  contas  magnéticas.  O  controle  do  enriquecimento  foirealizado através de uma reação de PCR, utilizando-se primers complementares ao sítio alvo darespectiva enzima de restrição. A recuperação preferencial de fragmentos contendo regiões SSRfoi confirmado por Southern Blot.Os  fragmentos  resultantes  de  cada  digestão  enzimática  e  enriquecidos  para  as  seqüênciasmicrossatélites  mencionadas  acima  foram  então  clonados  no  plasmídeo  PGEMT.  Através  dechoque térmico, células de E. coli  linhagem XL1Blue foram transformadas com os plasmídeosPGEMT clonados, resultando na construção de três bibliotecas genômicas de melão, Mse-AG/TC,Tsp-AC/TG e Tsp-AG/TC .Seleção e identificação de clones positivosA biblioteca Tsp  AG/TC foi avaliada para clones que continham a inserção de fragmentos comseqüências SSR pela hibridização das colônias transferidas para uma membrana de nylon comsondas  que  possuíam  seqüências  complementares  para  o  dinucleotídeo  para  o  qual  oenriquecimento  foi  realizado  (AG/TC).  A  confirmação  da  presença,  orientação  e  tamanho  domicrossatélite nos clones selecionados foi realizada através de uma série de cinco reações dePCR, conhecida como etapa do PCR-ancorado. O DNA plasmidial dos clones onde a inserçãomicrossatélite  for  confirmada  e  caracterizada  nesta  fase  foi  extraído  e  preparado  paraseqüenciamento.Sequenciamento dos clones positivos e desenho dos primersFirefox https://mail-attachment.googleusercontent.com/attachment/u/0/?ui=2&i...2 of 5 09/04/2024, 15:35As reações de sequenciamento estão sendo realizadas com a utilização dos kits "Dye-Terminator"e "Big-Dye". Em seguida, os fragmentos foram purificados e seqüenciados em um seqüenciadorautomático ABI-377.Pares de primers específicos, únicos e complementares às regiões que flaqueiam as seqüênciasmicrossatélites  estão  sendo  desenhados  utilizando-se  o  programa  PRIMER  (http\\www.genome.wi.mit.edu).  Além das características  mencionadas foram ainda consideradas aspossibilidades de auto-anelamento dos dois primers, o conteúdo G+C (50%) e a temperatura deanelamento das reações de PCR (55-60oC).Como  resultado  da  hibridização  das  colônias  desta  Biblioteca  com  a  sonda  (AG)13,  foramidentificados  324  clones  positivos,  contendo  possíveis  inserções  de  microssatélites.  Além  deconfirmar a seleção de 224 clones, reações de PCR ancorado foram usadas para identificar otamanho  e  orientação  das  regiões  microssatélites.  O  conhecimento  das  seqüências  queflanqueiam as repetições está sendo usado no desenho de primers visando a análise genômica demelão. Cerca de cem novos marcadores SSR foram desenhados e quarenta destes marcadores jáforam parcialmente caracterizados para utilização em análise genética de melão (Tabela 1). Asseqüências repetidas são do tipo (AG) e (TC), com um número de repetições bastante variável.Sete marcadores são do tipo composto,  apresentando também "motifs"  do tipo (AT),  (CA)  ou(CAT).  Seis  marcadores  são  do  tipo  imperfeito,  apresentando  seqüências  diferentes  entre  asrepetições e o restante é do tipo perfeito. Os procedimentos descritos no trabalho com a BibliotecaTsp-AG/TC serão realizados também com as outras Bibliotecas Genômicas já construídas, Mse-AG/TC e Tsp-AC/TG.Tabela 1. Caracterização dos novos marcadores SSR desenvolvidos para análise genômica de melão.Marcador Repetição TipoCM1 (TC)32(AT)3 compostoCM2 (AG)22 perfeitoCM3 (TC)20 perfeitoCM4 (AG)21 perfeitoCM5 (TC)18 perfeitoCM6 (TC)13 perfeitoCM7 (AG)30 perfeitoCM8 (TC)26 perfeitoCM9 (AG)27 perfeitoFirefox https://mail-attachment.googleusercontent.com/attachment/u/0/?ui=2&i...3 of 5 09/04/2024, 15:35CM10 (AG)17 perfeitoCM11 (TC)14 perfeitoCM12 (TC)15 perfeitoCM13 (TC)11 perfeitoCM14 (AG)23 perfeitoCM15 (AG)17 perfeitoCM16 (AG)18 perfeitoCM17 (AG)20 perfeitoCM18 (TC)20 perfeitoCM19 (CA)7(TC)34 compostoCM20 (CAT)3(TC)13(AT)8 compostoCM21 (TC)13 perfeitoCM22 (AG)24 perfeitoCM23 (TC)26(AT)4 compostoCM24 (TC)22 perfeitoCM25 (TC)24 perfeitoCM26 (GA)40 perfeitoCM27 (TA)3(TC)16 compostoCM28 (GA)28(GAA)(AAG)(GA) imperfeitoCM29 (GA)22(G)5T(GA)A(GA) imperfeitoFirefox https://mail-attachment.googleusercontent.com/attachment/u/0/?ui=2&i...4 of 5 09/04/2024, 15:35CM30 (TC)35 perfeitoCM31(GA)5(TA)(GA)3(GACA)2(GA)2imperfeitoCM32 (GAA)(GGA)(GA)20 perfeitoCM33 (GA)23 perfeitoCM34(TC)(T)(TC)8(CTCATT)(CTT)2 (C)(TC)2(CT)(T)2(TC)(CTCATT)(TC)3(CT)(G)(T)7(CT)compostoCM35(CT)19(CA)(CT)3(AT)(CT)2(T)(TC)3(AT)2compostoCM36 (CT)20 perfeitoCM37 (GA)34 perfeitoCM38(TA)4(CT)2(CCTCT)2(T)(CTT)(T)2(C)5(AT)(A)2(T)(CT)2(C)3(T)(C)3AA(CT)10(CCT)(TC)3(CT)6compostoCM39 (GA)2(G)5T(GA)CA(GA) imperfeitoCM40 (CT)15(T)3(C)(T)2(CT)2 imperfeitoFirefox https://mail-attachment.googleusercontent.com/attachment/u/0/?ui=2&i...5 of 5 09/04/2024, 15:35

Desenvolvimento de marcadores microssatelites (SSR) para melao (Cucumis melo).

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/769849/1/AP-CNPH-RITSCHEL-2001.pdf

Desenvolvimento de marcadores microssatelites (SSR) para melao (Cucumis melo).

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