Aggregation of the protein alpha synuclein (aSyn) and the resulting neurotoxicity play a crucial role in Parkinson’s disease (PD). Findings of recent studies strongly support the hypothesis that the progression of aSyn from one cell to adjacent cells contribute to the progression of PD. According to this hypothesis, the progression of aSyn includes important steps, like the release of this intracellular protein into the extracellular space, the subsequent uptake in neighboring cells, and the potential to trigger the aggregation of endogenous aSyn in recipient cells. However, in order to interact with intracellular pathways and to enable the following propagation of pathogenic aSyn species, the uptaken aSyn must be able to escape from the protein degradation mechanisms of the recipient cell. Therefore, the uptake and the subsequent processing of extracellular aSyn within the recipient cell are crucial for the propagation of aSyn pathology (aggregation and neurotoxicity). It is essential to understand the mechanisms of the propagation of aSyn, in order to find new therapeutic approaches.
This study focused on the uptake and deposition of extracellular aSyn, the following trafficking in recipient cells, as well as the potential effect of exogenous aSyn on recipient cells. For these purposes, H4 neuroglioma cells and rat primary hippocampal neurons were used as recipient cell models. To analyze the aggregation-dependent effects of extracellular aSyn on recipient cells, aSyn in different aggregation states (monomers, oligomers, and fibrils) was applied to cells.
All analyzed aSyn species showed a concentration and time dependent uptake pattern in recipient cells. Notably, the uptake of aggregated species (aSyn oligomers and fibrils) occurred more preferentially than monomeric aSyn. This effect was also commonly observed in other cell types. Moreover, aggregated aSyn accumulated in a time dependent manner in recipient cells and was capable of triggering the aggregation of endogenous aSyn. The uptake of extracellular aSyn occurred partly over clathrin dependent endocytosis, and the protein interacted subsequently with endosomes and lysosomes. In addition, part of exogenous aSyn was found in the cytoplasm, suggesting that aSyn partly escape from the endosomal/lysosomal system. In fact, the result from a more in-depth analysis suggested that exogenous aSyn is able to escape from endosomal vesicles through the translocon Sec61. Furthermore, the study provided evidence that the uptaken aSyn interacts with mitochondria, the ubiquitin-proteasome system (UPS), and the autophagy lysosomal pathway (ALP). However, the lysosomal morphology and function were particularly affected after the application of extracellular aSyn. Specifically, lysosomal expansion and accumulation were observed, accompanied by a reduced protein degradation capacity of lysosomes. Moreover, the autophagosomal lysosomal flux was disturbed. Importantly, lysosomal impairments were practically detected in cells exposed to aggregated aSyn species. In contrast to the disturbed lysosomal activity, the endocytosis activity, the proteasomal function and mitochondrial homeostasis of aSyn-exposed cells were not significantly affected. These results suggest that lysosomal impairments induced by extracellular, aggregated aSyn are early pathological events. The devastating lysosomal dysfunction and accumulation of exogenous aSyn can be prevented through a pretreatment of trehalose (a disaccharide molecule to activate autophagy).
Taken together, extracellular aggregated aSyn is more preferentially internalized into recipient cells and exhibits a higher potential to impair lysosomes than monomeric aSyn. The decreased protein clearance capacity of recipient cells promotes in turn the deposition of extracellular pathogenic species and the formation of new pathogenic species though aggregation of endogenous aSyn. This study reveals the importance of lysosomes and lysosome-related autophagy in the propagation of aSyn pathology and suggests these pathways as potential therapeutic targets in PD.Die Aggregation des Proteins Alpha-Synuclein (aSyn) und die daraus resultierende Neurotoxizität spielen eine entscheidende Rolle in der Parkinsonerkrankung (parkinson disease – PD). Neuste Studien unterstützen die Hypothese, dass eine Weitergabe des aSyn von einer Zelle zur Nachbarzelle zu der Progression der PD beiträgt. Nach dieser Hypothese beinhaltet die aSyn-Ausbreitung wichtige Schritte, wie die Freisetzung des intrazellulären Proteins in den extrazellulären Raum, dessen Aufnahme in die benachbarte Zelle, sowie das Potential die Anregung der Aggregation von endogenem aSyn in der Empfängerzelle auszulösen. Damit jedoch eine Interaktion mit den intrazellulären Strukturen und eine anschließende Verbreitung des pathogenen aSyn möglich ist, muss das aufgenommene aSyn dazu in der Lage sein, den Proteinabbaumechanismen der Zelle zu entkommen. Die Aufnahme von extrazellulärem aSyn in die Empfängerzellen und die anschließende Prozessierung haben daher für die aSyn-Pathologie (Aggregation und Neurotoxizität) eine äußerst wichtige Bedeutung. Es ist unerlässlich den Mechanismus zu verstehen, welcher der Ausbreitung von aSyn zugrunde liegt, um neue therapeutische Ansätze zu entwickeln.
In dieser Arbeit wurde die Aufnahme sowie die Ablagerung von extrazellulärem aSyn in den Empfängerzellen, das anschließende Verhalten dort, sowie die möglichen Auswirkungen auf die Empfängerzelle untersucht.
Um das aufgenommene aSyn in den Empfängerzellen zu verfolgen wurden H4-Neuroglioma Zellen und primäre rattenartige Neuronen als Modellsystemzellen verwendet. Um mögliche aggregationsabhängige Effekte von extrazellulärem aSyn auf die Empfängerzelle zu untersuchen, wurden die Zellen mit aSyn in unterschiedlichen Aggregationszuständen (Monomere, Oligomere und Fibrillen) behandelt.
Alle untersuchten aSyn-Spezies wurden konzentrations- und zeitabhängig von den Empfängerzellen aufgenommen. Interessanterweise fand die Aufnahme von aggregierten Spezies (aSyn-Oligomere und Fibrillen) bevorzugt statt. Dieser Effekt konnte auch in weiteren Zelltypen beobachtet werden. Hauptsächlich besaß aggregiertes aSyn die Fähigkeit, sich mit der Zeit in den Empfängerzellen abzulagern und darüber hinaus auch die Aggregation von endogenem aSyn anzuregen. Die Aufnahme von extrazellulärem aSyn in die Zelle fand teilweise über clathrinabhängige Endozytose statt und interagierte dann mit den Endosomen und Lysosomen der Zellen. Ein Teil des aSyn lag auch frei im Zytoplasma vor, was bedeutet, dass das aSyn dem endosomalen/lysosomalen Weg entkommt. Weitere Untersuchungen wiesen tatsächlich darauf hin, dass exogenes aSyn die endosomalen Vesikel über das Translokon Sec61 verlassen kann. Des Weiteren interagierte das aSyn auch mit den Mitochondrien der Zellen, sowie mit dem Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) und der Autophagiemachinerie. Es zeigten sich nach der Applikation von extrazellulärem aSyn vor allem Veränderungen in der lysosomalen Morphologie und Funktion. Es konnte eine lysosomale Vergrößerung und Akkumulation, welche mit einer reduzierten lysosomalen Abbauaktivität einhergeht, festgestellt werden. Darüber hinaus, wurde auch ein gestörter autophagolysosomaler Fluss beobachtet. Die beobachteten lysosomalen Störungen waren besonders in den Zellen, die den aggregierten aSyn-Spezies ausgesetzt waren, auffällig. Im Gegensatz zu der gestörten lysosomalen Aktivität zeigten sich keine großen Veränderungen in der Endozytose-Aktivität, der proteasomalen Funktion, sowie der mitochondrialen Homöostase. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es sich bei den lysosomalem Veränderungen, welche durch extrazelluläres, aggregiertes aSyn hervorrufen werden können, um ein frühes pathologisches Ereignis handelt. Die massiven Störungen der Lysosomen, sowie die Akkumulation von exogenem aSyn konnten durch eine zusätzliche Behandlung mit Trehalose (ein Disaccharid, welches die Autophagie aktiviert) verringert werden.
Zusammengefasst wurde extrazelluläres, aggregiertes aSyn bevorzugt von den Zellen internalisiert. Dort inhibierte es die lysosomale Aktivität, wodurch eine Akkumulation und eine weitere Bildung von pathogenem aSyn in den Empfängerzellen begünstigt wurde. Diese Studie unterstreicht deutlich eine wichtige Rolle der Lyososmen und der lysosomenassoziierten Autophagie in der Propagation der aSyn-Pathologie und deutet damit auf Lysosomen als potentielle therapeutische Angriffsziele gegen PD hin
