Viruses, especially emerging and re-emerging positive-sense single-stranded RNA ((+)ssRNA) viruses, such as the severe acute respiratory syndrome coronavirus - 2 (SARS-CoV-2), have caused several epidemic and pandemic outbreaks in the last decades. There are only few approved antiviral drugs available against (+)ssRNA viruses and they rarely show sufficient efficacy when repurposed against emerging
viruses.
The major drug target in viruses is the viral replication machinery, i.e. the replication-transcription complex (RTC), which is responsible for the synthesis of the viral genome and as such is a vital part in the replication cycle of the virus.
Most antiviral drugs that target the RTC are nucleotide analogs, which are modified natural nucleotides that can be used as substrate for RNA synthesis by the RTC. They can e.g. inhibit RNA product extension or induce mutations. To find (new) effective nucleotide analogs against the viral RTC, it is necessary to understand how the RTC
incorporates naturally occurring nucleotides, which parts of this process are influenced by the incorporation of nucleotide analogs and how the nucleotide analogs affect RNA synthesis dynamics.
The incorporation of a nucleotide analog is a rare event, similar to mismatch incorporation, that happens asynchronous between different RTCs. These events are hidden in standard biochemical bulk assays in the presence of competing natural nucleotides at physiological concentration. Single-molecule techniques by contrast allow for the observation of single enzymes, which in turn enables us to observe rare events, even in the presence of saturating concentrations of the competing natural nucleotides.
Here, we used high-throughput magnetic tweezers as a single molecule force spectroscopy technique for the simultaneous observation of hundreds of RNA template, which therefore allows for the rapid collection of large statistics. A pair of permanent magnets exerts an attractive force to magnetic beads, which are tethered to the surface of a flow chamber by the template RNAs. The RTC’s RNA elongation activity modifies the end-to-end extension of the tether, and therefore the vertical position of the magnetic bead, which we tracked in real-time using a CMOS camera. We used the position of the bead to extract the RTC kinetics based on first-passage analysis and Maximum Likelihood Estimation.
To generate a large number of available templates per experiment, we optimized the fabrication method to produce hairpin and linear RNA constructs that are suitable template for RTC assembly and elongation and provide a visible change in extension during the experiment with high purity and yield.
As the temperature, at which viral RTCs naturally work, is often above room temperature, we outfitted our magnetic tweezers assay with a heating device and calibrated the
temperature precisely using DNA as a temperature sensor.
As proof of principle, we used our magnetic tweezers assay to investigate the influence of temperature on the RNA synthesis activity of poliovirus RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), for which the mechanochemical mechanism has already been investigated in depth.
We then used our temperature-controlled high-throughput magnetic tweezers assay to study SARS-CoV-2 replication. Based on the effects of force and nucleotide concentration on the RNA synthesis dynamics, we were able to develop a kinetic model for nucleotide addition, containing three catalytic pathways. These pathways only differ in the duration, while the steps in the nucleotide addition cycles is conserved for the three pathways. We also provide the first evidence that the translocation step, i.e. the
downstream movement of the SARS-CoV-2 polymerase on the template, is based on a thermal ratchet mechanism and not a power stroke.
Based on these results, we investigated the effect of several nucleotide analogs, which have been suggested as drugs against SARS-CoV-2 infections. Our single molecule investigation revealed that 2′ and 3′ ribose modified nucleotide analogues are incorporated via the main fast catalytic pathways, while base- and 1′ ribose modified nucleotide analogues were incorporated via the two slow catalytic pathways. Furthermore, we demonstrated that Remdesivir, the only FDA approved drugs to treat SARS-CoV-2 infection does not terminate RNA synthesis, but rather induces long pauses related to polymerase
backtracking.
To summarize, this thesis describes the development of a temperature-controlled high-throughput magnetic tweezers assay and high quality RNA template to elucidate the nucleotide addition cycle of SARS-CoV-2 and the identification of the mechanism of action and efficacy of several nucleotide analogs. The results pave the way towards high spatiotemporal characterization and therefore an in-depth fundamental understanding the mechanism of action of antiviral drugs.Viren, insbesondere neu- oder wiederauftretenden (+)ssRNA Viren, wie das severe acute respiratory syndrome coronavirus-2, haben in den vergangenen Jahrzehnten viele Enepidemien und -pandemien verursacht. Es gibt nur wenige zugelassene antivirale Medikamente gegen (+)ssRNA Viren und diese zeigen selten ausreichende Wirksamkeit, wenn sie gegen neuauftretende Viren verwendet werden.
Als Angriffspunkt für antivirale Medikamente eignet sich besonders die virale Replikationsmaschinerie (eng. replication-transcription complex, RTC), die für die Synthese des gesamten viralen Genoms verantwortlich und somit ein zentraler Bestandteil des viralen Replikationszyklus ist.
Die meisten Wirkstoffe, die den RTC angreifen, sind sogenannte Nukleotidanaloga, natürlich vorkommende Nukleotide, die modifiziert wurden und von dem RTC als Substrat für die RNA Synthese verwendet werden können. Um (neue) wirksame Nukleotidanaloga gegen einen bestimmten Virus zu finden, muss man zunächst verstehen, wie der RTC natürlich vorkommende Nukleotide einbaut, welche Abschnitte dieses Prozesses durch Nukleotidanaloga beeinflusst werden und wie Nukleotidanaloga die RNA-Synthesedynamik beeinflusst.
Der Einbau eines Nukleotidanalogons durch den RTC stellt ein seltenes Ereignis dar, ähnlich dem Einbau einer Nukleotidfehlpaarung, das bei den RTCs asynchron stattfindet. Diese seltenen Ereignisse sind bei biochemischen Standardmessungen in Messungen mit konkurrierenden natürlich vorkommenden Nukleotiden nicht sichtbar.
Bei Einzelmolekülmethoden hingegen können einzelne Enzyme beobachtet werden, was es wiederum erlaubt auch unter Bedingungen mit saturierenden Konzentrationen an natürlich vorkommenden Nukleotiden seltene Ereignisse zu beobachten.
Hier haben wir eine temperaturkontrollierte, hochdurchsätzende magnetische Pinzette als Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Methode verwendet, um hunderte RTCs in parallel zu beobachten, was es uns ermöglichte schnell eine große Menge an Stichproben zu messen. Ein Paar permanenter Magneten übt eine anziehende Kraft auf magnetische
Kügelchen aus, die durch Matrizen-RNAs mit der Oberfläche einer Durchflusskammer
verbunden sind. Durch die RNA-Syntheseaktivität des RTC ändert sich die Ende-zu-Ende Distanz der RNA und dadurch bedingt die vertikale Position des magnetischen
Kügelchens, die wir in Echtzeit mit einer CMOS Kamera verfolgten. Wir verwendeten diese Position um die Kinetik des RTC mithilfe der Erstpassagezeitanalyse und der
Größte-Dichte-Methode. Um eine möglichst große Anzahl an Matrizensträngen pro
Experiment zur Verfügung zu haben, haben wir die herstellungsmethoden optimiert, um lineare RNA und RNA-Haarnadelstrukturen n großer Anzahl und Reinheit, die geeignete Matrizen für den Zusammenbau des RTC und dessen Elongationsaktivität darstellen und eine sichtbare Änderung ihrer Länge während des Experiments zeigen, zu produzieren.
Da die Temperaturen, bei denen der virale RTC normalerweise arbeitet, oft über der
Raumtemperatur sind, haben wir unsere magnetische Pinzette mit einer Heizung ausgestattet und diese präzise mithilfe einer DNA-Sonde kalibriert Als Machbarkeitsnachweis haben wir unsere magnetische Pinzette genutzt, um den Einfluss von Temperatur auf das RNA–Syntheseverhalten der Replikationsmaschinerie des Poliovirus, der RNA-abhängigen RNA Polymerase (eng. RNA-dependent RNA polymerase, RdRp), zu untersuchen, für die die mechanochemische Funktionsweise bereits im Detail untersucht
wurde.
Im Anschluss verwendeten wir die temperaturkontrollierte, hochdurchsätzende magnetische Pinzette, um die SARS-CoV-2 Replikation zu untersuchen.
Ausgehend von dem beobachteten Einfluss von Kraft und Nukleotidkonzentration auf die RNA-Syntheseaktivität haben wir ein Modell für die Nukleotidaddition erstellt, das drei katalytisch aktive Pfade beinhaltet. Diese Pfade variieren nur in ihrer Dauer, während die einzelnen Schritte gleich sind. Wir lieferten außerdem den ersten Beweis, dass die Translokation, also die strangabwärtige Bewegung der SARS-CoV-2 Polymerase,
auf einer molekularen Ratsche und nicht auf einem Kraftschlag basiert.
Ausgehend von unseren Resultaten untersuchten wir den Effekt verschiedener Nukleotidanaloga auf die SARS-CoV-2 Polymerase, die als Medikamente gegen SARS-CoV-2 Infektionen vorgeschlagen wurden. Unsere Einzelmolekülstudie zeigte, dass Nukleotidanaloga mit Modifikationen an 2′ oder 3′ Positionen der Ribosedurch den schnellen
Hauptpfad eingebaut werden, während Nukleotidanaloga mit Modifikationen an der 1′ Position der Ribose oder an der Base über die beiden langsameren Pfade eingebaut werden. Wir konnten außerdem zeigen, dass Remdesivir, das einzige momentan von der FDA zugelassene Medikament gegen SARS-COV-2 Infektionen, nicht wie bislang angenommen zu einem verspäteten Kettenabbruch führt sondern langlebige Synthesepausen mit Rückwärtsbewegung (backtrack) der SARS-CoV-2 Polymerase auf der RNA verursacht.
Zusammengefasst wird in dieser Arbeit die Entwicklung einer temperaturkontrollierten, hochdurchsätzenden magnetischen Pinzette und hochwertiger RNA Konstrukte beschrieben, mithilfe derer der Nukleotidadditionszyklus der SARS-CoV-2 Polymerase aufgeklärt wurde und sowohl Wirkmechanismus als auch Wirksamkeit verschiedener
Nukleotidanaloga bestimmt wurde. Diese Resultate ebnen den Weg für eine hochaufgelöste räumlich-zeitliche Charakterisierung, und damit auch ein grundlegendes Verstäntnis, des Wirkmechanismus antiviraler Medikamente
