Cuantificación de hormonas vegetales y estudio metabolómico mediante cromatografia-espectrometría de masas de alta resolución. Aplicación a la interacción alfalfa-PGPR

Abstract

La existencia de interacciones beneficiosas entre las bacterias presentes en el suelo y las plantas se conoce desde hace más de un siglo y está firmemente contrastada en diversos tipos de cultivos. Estas interacciones producen un beneficio para ambas partes ya que, al asociarse, las bacterias mejoran su crecimiento y desarrollo, a la vez que protegen a la planta frente a organismos patógenos del suelo. Aunque el ejemplo más conocido de asociación beneficiosa es la simbiosis entre las bacterias fijadoras de nitrógeno (rizobios) y las plantas leguminosas, actualmente se conocen otros microorganismos asociados a las plantas capaces de mejorar el crecimiento de las mismas. El término PGPR (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria) se utiliza para referirse a microorganismos de vida libre que, al interaccionar con la planta bien de forma endófita o bien colonizando la raíz, favorecen el crecimiento de la misma. El efecto de las PGPR puede tener su origen en su acción como fertilizadores del suelo gracias a su capacidad para movilizar nutrientes, como productores de hormonas vegetales que modifican la fisiología de las plantas, como agentes protectores frente a diversos patógenos o por su capacidad para mejorar la respuesta de la planta al estrés al que está sometida en condiciones de sequía, exceso de salinidad o en suelos degradados. Uno de los mecanismos de acción de las PGPR es la modificación del balance hormonal de la planta de forma directa mediante la producción de auxinas (por ejemplo, el ácido 3- indolacético) y la modificación de los niveles de acetileno mediante la producción de ácido abscísico (ABA) y la eliminación de ácido 1-aminociclopropanocarboxílico (ACC), lo que permite una mayor protección frente a estrés abiótico, entre otros fenómenos. Un segundo mecanismo se basa en la adquisición de resistencia sistémica (SAR) en la planta, aumentando su capacidad de defensa frente a organismos patógenos. En este último caso, hay dos posibles canales de actuación: uno mediado por el ácido jasmónico (JA) y otro mediado por ácido salicílico (SA). En esta Tesis Doctoral se ha desarrollado un método para la determinación de fitohormonas procedentes de plantas de alfalfa (Medicago sativa) basado en extracción sólidolíquido y el análisis por cromatografía líquida de ultra alta resolución acoplada a espectrometría de masas en tándem (UPLC-MS/MS) para la determinación cualitativa y cuantitativa de las fitohormonas SA, ABA y JA. Este método ha sido validado para el análisis cuantitativo de las fitohormonas SA y ABA en las plantas de alfalfa. La aplicación de esta metodología al estudio comparativo entre plantas inoculadas por microorganismos con capacidad PGPR, en nuestro caso Bacillus sp. Per82, permitirá determinar sus mecanismos de acción. Adicionalmente, se ha realizado un estudio comparativo de otros metabolitos presentes, usando técnicas de Metabolómica basadas espectrometría de masas de alta resolución (HRMS). En el estudio de Metabolómica Dirigida se han desarrollado diferentes métodos de análisis UHPLC-HRMS/MS y GC-HRMS, que nos han permitido determinar metabolitos de diferente naturaleza (aminoácidos, ácidos orgánicos, fitohormonas, compuestos fenólicos, flavonoides y azúcares). En el estudio de Metabolómica No Dirigida se han empleado plataformas de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (UHPLCHRMS/ MS) en plantas de alfalfa, permitiendo obtener el conjunto total de metabolitos de la matriz en estudio (metaboloma). Haciendo uso de herramientas estadísticas se han puesto de manifiesto las diferencias más importantes que aparecen en las distintas condiciones y los principales metabolitos involucrados en dichas diferencias