BROYLER TAVUKLARDAN ELDE EDİLEN SALMONELLA INFANTİS İZOLATLARININ İNTEGRON, ANTİMİKROBİYAL DİRENÇ VE VİRÜLENS GEN PROFİLLERİNİN İNCELENMESİ

Abstract

Amaç: Broyler tavuklardan elde edilen Salmonella enterica subsp. enterica serovar Infantis izolatlarında integron, antimikrobiyal direnç ve virülens gen profillerinin araştırılmasıdır. Gereç ve Yöntem: Broyler tavuklardan elde edilen toplam 255 Salmonella izolatı kullanıldı. Salmonella izolasyonu, TS EN ISO 6579-1:2017 standardına göre yapıldı. İzolatların cins (invA) ve tür (serovar Enteritidis için sefA, serovar Typhimurium için spy, serovar Infantis için fljB) düzeyinde doğrulanması, integron (int1, int2) ve virülens gen (sopB, pipD, sopE, sifA, stn, spaN, spvC, slyA, hilA, spvR) profillerinin belirlenmesi için polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) kullanıldı. İzolatların sekiz antimikrobiyal aileye ait sekiz antibiyotiğe karşı direnç profilleri disk difüzyon yöntemi ile incelendi. İzolatların çoklu antibiyotik direnç (MDR) durumları ile integron ve virülens genlerinin varlığı arasındaki ilişki; ayrıca, integron genlerinin varlığı ile virülens genlerinin varlığı ve antimikrobiyal direnç arasındaki ilişki Pearson Ki-Kare (χ2) testi kullanılarak incelendi. Bulgular: Tür spesifik PZR sonuçlarına göre izolatların %62,3'ü S. Infantis olarak identifiye edildi. S. Infantis izolatları arasında en yüksek direnç trimetoprim/sülfametoksazol, tetrasiklin (%89,3) ve amoksisilin/klavulanik aside (%62,9) karşı belirlenirken en etkili antibiyotikler ampisilin ve gentamisin olarak belirlendi. S. Infantis izolatlarının %61,0'i MDR’ye sahip iken %96,8'i integron geni taşıyordu. İzolatların, bazı virülens genlerini (sopB, pipD, sifA, stn, spaN, slyA, hilA) yüksek (%93,7-%96,8) yüksek, bazı virülens genlerini ise (sopE, spvC, spvR) daha düşük oranlarda (%11,9-%3,1) taşıdıkları tespit edildi. Yapılan istatistiksel analiz sonrasında, integron genlerinin varlığı ile bazı antibiyotiklere (gentamisin ve ampisilin) karşı direnç ve xiv belirli virülens genlerinin (sopB, pipD, spaN, spvC, slyA, hilA, spvR) varlığı arasında anlamlı bir ilişki saptandı. Sonuç: Broyler tavuklardan elde edilen MDR’ye sahip S. Infantis izolatlarında yüksek düzeyde integron ve virülens genlerinin belirlenmesi; bu patojenin ilaç direncini ve hastalık yapma potansiyelini anlamak için önemlidir ve etkili tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir.İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY ........................................................................................................... i TEŞEKKÜR ....................................................................................................................... i İÇİNDEKİLER ................................................................................................................ iii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ................................................................... vii ŞEKİLLER DİZİNİ ........................................................................................................... x TABLOLAR DİZİNİ ...................................................................................................... xii ÖZET.............................................................................................................................. xiii ABSTRACT .................................................................................................................... xv 1. GİRİŞ ............................................................................................................................ 1 2. GENEL BİLGİLER ...................................................................................................... 4 2.1. Salmonella Türlerinin Tarihçesi ................................................................................. 4 2.2. Salmonella Türlerinin Sınıflandırılması ..................................................................... 4 2.3. Salmonella Türlerinin Özellikleri .............................................................................. 5 2.3.1. Morfolojik ve Biyokimyasal Özellikleri ................................................................. 5 2.3.2. Antijenik Özellikleri................................................................................................ 7 2.4. Salmonella Türlerinde Epidemiyoloji ........................................................................ 8 2.5. Salmonella Türlerinin Patogenezi .............................................................................. 9 2.5.1. Salmonella Türlerinin Virülens Faktörleri ............................................................ 10 2.5.1.1. Salmonella Patojenite Adaları ............................................................................ 10 2.5.1.2. Salmonella Virülens Plazmidleri........................................................................ 17 2.5.1.3. Flagella ............................................................................................................... 18 2.5.1.4. Fimbria ............................................................................................................... 18 2.5.1.5. Sideroforlar ........................................................................................................ 19 iv 2.5.1.6. Toksinler ............................................................................................................ 19 2.6. Antimikrobiyal Direnç ............................................................................................. 20 2.6.1. Antibiyotiklere Direnç Gelişim Mekanizmaları .................................................... 21 2.6.1.1. Biyokimyasal Yollar .......................................................................................... 21 2.6.1.1.1. Enzimatik inaktivasyon ................................................................................... 21 2.6.1.1.2. Hedef modifikasyonu ...................................................................................... 22 2.6.1.1.3. Effluks pompası ve dış membran geçirgenliğindeki değişim ......................... 22 2.6.1.1.4. Antibiyotik inaktivasyonu ............................................................................... 22 2.6.1.2. Genetik Yollar .................................................................................................... 22 2.6.1.2.1. Horizontal gen transferi................................................................................... 23 2.7. S. Infantis’in Salmonellozis’teki Önemi .................................................................. 27 3. GEREÇ VE YÖNTEM ............................................................................................... 29 3.1. Gereç ........................................................................................................................ 29 3.1.1. İzolasyon Materyali ............................................................................................... 29 3.1.1.1. Drag Svap Örneklerinin Alınması ...................................................................... 29 3.1.2. Pozitif Kontrol ve Negatif Kontrol Suşları ........................................................... 30 3.1.3. Besiyerleri ............................................................................................................. 30 3.1.3.1. Tamponlanmış peptonlu su ................................................................................ 30 3.1.3.2. Modifiye yarı katı rappaport vassiliadis besiyeri .............................................. 31 3.1.3.3. Mueller Kauffmann tetrathionate novobiocin broth .......................................... 32 3.1.3.4. Ksiloz lizin deoksikolat agar .............................................................................. 34 3.1.3.5. Kolumbia kanlı agar … ...................................................................................... 35 3.1.3.6. MacConkey agar … ........................................................................................... 36 3.1.3.7. Nutrient agar…................................................................................................... 37 3.1.3.8. Nutrient broth….. ............................................................................................... 38 3.1.3.9. Mueller hinton agar… ........................................................................................ 39 v 3.1.3.10. Brain hearth infusion broth …… ..................................................................... 40 3.1.3.11. Üre indol besiyeri ............................................................................................. 41 3.1.4. Boya ve Ayraçlar................................................................................................... 42 3.1.4.1. Gram boyama seti ….. ....................................................................................... 42 3.1.4.2. Kovaks indol ayracı ….. .................................................................................... 42 3.1.4.3. Oksidaz ayracı.. .................................................................................................. 43 3.1.4.4. Hidrojen peroksit….. .......................................................................................... 43 3.1.5. Antiserumlar .......................................................................................................... 43 3.1.6. Antibiyotik Diskleri .............................................................................................. 43 3.1.7. Polimeraz Zincir Reaksiyonu ................................................................................ 44 3.1.7.1. Solüsyon ve boyalar ........................................................................................... 44 3.1.7.1.1. Tris, borik asit, EDTA buffer ......................................................................... 44 3.1.7.2. Yükleme tamponu .............................................................................................. 44 3.1.7.3. Primerler ............................................................................................................. 45 3.1.7.4. Agaroz jel ........................................................................................................... 47 3.1.7.5. Kullanılan cihazlar ............................................................................................. 48 3.1.7.6. Marker ................................................................................................................ 48 3.2. Yöntem ..................................................................................................................... 49 3.2.1. Salmonella spp. İzolasyonu ve Fenotipik İdentifikasyonu ................................... 49 3.2.1.1. Birinci Gün: Ön Zenginleştirme......................................................................... 50 3.2.1.2. İkinci Gün: Zenginleştirme ................................................................................ 50 3.2.1.3. Üçüncü Gün: Selektif Katı Besiyerine Zenginleştirme Amaçlı İnokülasyon .... 51 3.2.1.4. Dördüncü Gün: Değerlendirme .......................................................................... 52 3.2.1.5. Beşinci Gün: Biyokimyasal Doğrulama ............................................................ 52 3.2.1.6. Altıncı Gün: Serolojik Doğrulama Testleri ........................................................ 53 3.2.2. Genotipik İdentifikasyon ....................................................................................... 55 vi 3.2.3. Sekans Analizi ....................................................................................................... 58 3.2.4. Antibiyotik Duyarlılık Testi .................................................................................. 59 3.2.5. İstatistiksel Analiz ................................................................................................. 60 4. BULGULAR ............................................................................................................... 61 4.1. İzolasyon .................................................................................................................. 61 4.2. İdentifikasyon ........................................................................................................... 62 4.3. Sekans Analizi ........................................................................................................ 644 4.4. Virülens Genotiplendirme ........................................................................................ 66 4.5. İntegronların Varlığı............................................................................................... 689 4.6. Antibiyotik Direnci .................................................................................................. 70 4.7. İstatistiksel Analiz .................................................................................................... 71 5. TARTIŞMA ................................................................................................................ 75 6. SONUÇ VE ÖNERİLER ............................................................................................ 83 KAYNAKLAR ............................................................................................................... 85 EKLER .......................................................................................................................... 100 Ek 1. S. Infantis izolatlarının virülens gen, integron ve antibiyotik direnç durumları..100 Ek 2. (ADÜ-HADYEK)..……………………………………………………………..104 BİLİMSEL ETİK BEYANI .......................................................................................... 105 ÖZ GEÇMİŞ ................................................................................................................. 10