A leptospirose é uma zoonose generalizada no mundo. Atualmente, as vacinas comerciais disponíveis não oferecem proteção heteróloga contra todos os sorovares leptospirais. Assim, é importante identificar alvos conservados e capazes de induzir imunidade protetora de amplo espectro. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar a antigenicidade de proteínas recombinantes de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, a fim de selecionar candidatos para o desenvolvimento de uma vacina recombinante contra a leptospirose. Após análise in silico, cinco lipoproteínas foram selecionadas (LIC10463, LIC10498, LIC10666, LIC11889 e LIC12666), clonadas e expressas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia de afinidade. As proteínas recombinantes rLIC10463, rLIC10498, rLIC10666 e rLIC11889 obtidas demonstraram potencial antigênico e, portanto, podem ser utilizadas em ensaios de imunogenicidade e imunoproteção em modelo animal.

da Silva, Éverton Fagonde

Dewes, Caroline

Fortes, Tanise Pacheco

Machado, Gilmar Batista

Neto, Amilton Clair Pinto Seixas

Pacheco, Paula Soares

Silva, João Pedro Mello

Vasconcellos, Flávia Aleixo

Portuguese

Brazilian Journals

56629 Brazilian Journal of Development Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 8, p.56629-56636 aug. 2020. ISSN 2525-8761   Potencial antigênico de proteínas recombinantes de Leptospira Interrogans  Antigenic potential of recombinant proteins from Leptospira Interrogans  DOI:10.34117/bjdv6n8-177  Recebimento dos originais: 13/07/2020 Aceitação para publicação: 13/ 08/2020  Tanise Pacheco Fortes Doutora pelo Programa de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas Instituição: Universidade Federal de Pelotas – UFPel Endereço: Avenida Eliseu Maciel, Campus Universitário, S/N - Capão do Leão – RS, Brasil E-mail: tanisefortes@gmail.com  Amilton Clair Pinto Seixas Neto Doutor pelo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas Instituição: Universidade Federal de Pelotas – UFPel Endereço: Avenida Eliseu Maciel, Campus Universitário, S/N - Capão do Leão – RS, Brasil E-mail: amiltonseixas@gmail.com  Gilmar Batista Machado Doutor pelo Programa de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas Instituição: Universidade Federal de Pelotas – UFPel Endereço: Avenida Eliseu Maciel, Campus Universitário, S/N - Capão do Leão – RS, Brasil E-mail: gilmar.machado84@hotmail.com  Caroline Dewes Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas Instituição: Universidade Federal de Pelotas – UFPel Endereço: Avenida Eliseu Maciel, Campus Universitário, S/N - Capão do Leão – RS, Brasil E-mail: caroldewesvet@hotmail.com  Paula Soares Pacheco Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas Instituição: Universidade Federal de Pelotas – UFPel Endereço: Avenida Eliseu Maciel, Campus Universitário, S/N - Capão do Leão – RS, Brasil E-mail: paulassoarespacheco@gmail.com  João Pedro Mello Silva Discente do curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Pelotas Instituição: Universidade Federal de Pelotas – UFPel Endereço: Avenida Eliseu Maciel, Campus Universitário, S/N - Capão do Leão – RS, Brasil E-mail: jptam97@gmail.com 56630 Brazilian Journal of Development Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 8, p.56629-56636 aug. 2020. ISSN 2525-8761   Flávia Aleixo Vasconcellos Doutora pelo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas Instituição: Universidade Federal de Pelotas – UFPel Endereço: Avenida Eliseu Maciel, Campus Universitário, S/N - Capão do Leão – RS, Brasil E-mail: aleixo.fv@gmail.com  Éverton Fagonde da Silva Docente da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas Instituição: Universidade Federal de Pelotas – UFPel Endereço: Avenida Eliseu Maciel, Campus Universitário, S/N - Capão do Leão – RS, Brasil E-mail: fagondee@gmail.com   RESUMO A leptospirose é uma zoonose generalizada no mundo. Atualmente, as vacinas comerciais disponíveis não oferecem proteção heteróloga contra todos os sorovares leptospirais. Assim, é importante identificar alvos conservados e capazes de induzir imunidade protetora de amplo espectro. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar a antigenicidade de proteínas recombinantes de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, a fim de selecionar candidatos para o desenvolvimento de uma vacina recombinante contra a leptospirose. Após análise in silico, cinco lipoproteínas foram selecionadas (LIC10463, LIC10498, LIC10666, LIC11889 e LIC12666), clonadas e expressas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia de afinidade. As proteínas recombinantes rLIC10463, rLIC10498, rLIC10666 e rLIC11889 obtidas demonstraram potencial antigênico e, portanto, podem ser utilizadas em ensaios de imunogenicidade e imunoproteção em modelo animal.  Palavras-chave: Leptospira, vacinologia reversa, antigenicidade, antígenos recombinantes.  ABSTRACT Leptospirosis is a widespread zoonosis in the world. Currently, the commercial vaccines available do not offer heterologous protection against all leptospiral serovars. Thus, it is important to identify targets conserved and capable of inducing broad-spectrum protective immunity. In this context, the objective of this study was to evaluate the antigenicity of recombinant proteins from Leptospira interrogans serovar Copenhageni, in order to select candidates for the development of a recombinant vaccine against leptospirosis. After in silico analysis, five putative lipoproteins were selected (LIC10463, LIC10498, LIC10666, LIC11889, and LIC12666), cloned and expressed in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. The recombinant proteins rLIC10463, rLIC10498, rLIC10666 and rLIC11889 obtained demonstrated antigenic potential and, therefore, can be used in immunogenicity and immunoprotection assays in animal model.  Keywords: Leptospira, reverse vacinology, antigenicity, recombinant antigens. 56631 Brazilian Journal of Development Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 8, p.56629-56636 aug. 2020. ISSN 2525-8761   1 INTRODUÇÃO A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial causada por espécies patogênicas de Leptospira (Adler, 2014). A doença é frequente em regiões de clima tropical, como o Brasil, onde aumentos na incidência costumam ser observados durante a estação chuvosa (Blanco et al., 2016). Os hospedeiros suscetíveis adquirem a infecção através do contato com a urina, água ou solo contaminados com a bactéria (Murray, 2013). Depois de penetrar no organismo, a disseminação das leptospiras acontece rapidamente para órgãos como fígado, pulmões e rins, onde elas podem realizar a colonização (Adler, 2014; Blanco et al., 2016). Atualmente, as vacinas disponíveis contra a leptospirose são bacterinas, as quais induzem uma resposta imune humoral predominantemente contra o lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano (Zeng et al., 2015). Nas leptospiras, o LPS é uma estrutura altamente variável, possuindo diferenças significativas entre os sorovares, o que torna as bacterinas incapazes de fornecer proteção contra aqueles sorovares que não fazem parte da preparação vacinal (Pinne e Haake, 2009). Diante deste cenário, a identificação de fatores de virulência bacterianos reconhecidos durante os primeiros estágios da resposta imune e que possam ser utilizados no desenvolvimento de uma vacina recombinante capaz de fornecer proteção cruzada, tornou-se importante (Gamberini et al., 2005). Nos últimos anos, o sequenciamento e a anotação dos genomas microbianos possibilitou a identificação de potenciais antígenos para o desenvolvimento de vacinas (Gamberini et al., 2005). As proteínas da membrana externa de leptospira (OMP), lipoproteínas e Leptospiral immunoglobulin-like proteins (Ligs) tem sido avaliadas como candidatos vacinais em modelo animal. Diferentes grupos de pesquisa já testaram a atividade protetora de proteínas recombinantes de Leptospira como vacinas, revelando que nem todas parecem capazes de conferir proteção parcial em hamsters contra o desafio com bactérias virulentas. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar a antigenicidade de proteínas recombinantes de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, a fim de selecionar candidatos para o desenvolvimento de uma vacina recombinante contra a leptospirose.  2 MATERIAL E MÉTODOS Para a realização deste estudo, Leptospira interrogans sorovar Copenhageni foi cultivada em meio Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) líquido e mantida a 29°C em estufa bacteriológica. A extração do DNA genômico foi realizada utilizando kit comercial illustra™ bacteria genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare®). Para clonagem e expressão heteróloga, foram utilizadas as cepas Escherichia coli TOP10 (Invitrogen®) e E. coli BL21 Star (DE3) 56632 Brazilian Journal of Development Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 8, p.56629-56636 aug. 2020. ISSN 2525-8761   (ThermoFisher®), cultivadas a 37°C em meio Luria-Bertani (LB). A seleção das sequências codificadoras foi realizada com base nas informações disponíveis no GenBank (NCBI) e a escolha foi baseada em informações sobre proteínas correspondentes, obtidas a partir de análises no banco de dados UniProt Knowledgebase (UniProt KB). Os primers foram desenhados com o auxílio do software Vector NTI 11 (Invitrogen®) e sítios para enzimas de restrição foram adicionados em cada uma das extremidades, permitindo a clonagem no vetor pAE de expressão heteróloga em E. coli. Após a extração do DNA genômico, os genes foram amplificados através da reação em cadeia da polimerase (PCR) e os amplicons foram analisados através de eletroforese em gel de agarose (Silva et al., 2007). Os genes foram amplificados no vetor pAE (Ramos et al., 2004) e utilizados para transformar células de E. coli TOP10 através de choque térmico. Os plasmídeos recombinantes resultantes foram utilizados para transformar a cepa E. coli BL21 Star (DE3) e a expressão dos genes LIC10463, LIC10498, LIC10666, LIC11889 e LIC12666 foi induzida pelo uso de isopropil β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG). As proteínas resultantes foram purificadas através de cromatografia de afinidade com colunas de sefarose e níquel (Ni+2) e dialisadas para que voltassem à sua conformação original (Silva et al., 2007). As proteínas recombinantes obtidas foram submetidas à eletroforese com gel 12% (SDS-PAGE) para estimar a massa molecular e a pureza das preparações. A quantificação dos lotes produzidos foi realizada pelo método de Bradford ou BCA. Para o ensaio de antigenicidade, as proteínas recombinantes foram submetidas a um Western Blotting com soros obtidos de pacientes convalescentes de leptospirose, utilizando-se para a detecção primária um anticorpo comercial de cabra anti-humano conjugado com peroxidase. A reação foi revelada com diaminobenzidina (DAB) e H2O2.  3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Neste estudo, cinco genes (LIC10463, LIC10498, LIC10666, LIC11889 e LIC12666) foram identificados através do uso de ferramentas de bioinformática e eficientemente amplificados a partir do DNA genômico de L. interrogans sorovar Copenhageni através de PCR (Figura 1). 56633 Brazilian Journal of Development Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 8, p.56629-56636 aug. 2020. ISSN 2525-8761   Figura 1. Amplificação dos genes selecionados por PCR. (M) Marcador de peso molecular 1kb plus DNA ladder (Invitrogen®); (1) LIC11889 - 855 pb (pares de bases); (2) LIC10498 – 890 pb; (3) LIC10666 – 338 pb; (4) LIC12666 – 405 pb; e (5) LIC10463 – 496 pb.    Os clones recombinantes foram selecionados através de triagem e os vetores recombinantes foram detectados através de visualização em gel de agarose A digestão enzimática foi realizada com o objetivo de confirmar a presença dos insertos no vetor pAE e resultou em um padrão de fragmentos com o tamanho esperado para cada uma das construções (dados não mostrados). As proteínas recombinantes rLIC11889. rLIC10666, rLIC10498 e rLIC10463 foram expressas na forma de corpúsculos de inclusão insolúveis e purificadas através de cromatografia de afinidade. A pureza, estabilidade e quantidade das proteínas obtidas foram avaliadas através de SDS-PAGE (Figura 2), enquanto a antigenicidade foi testada por Western Blotting (dados não mostrados). Não foi possível purificar o alvo LIC12666 e, dessa forma, este foi excluído da etapa de antigenicidade.  Figura 2. Análise da pureza e aparente peso molecular das proteínas por SDS-PAGE. Todas as proteínas purificadas foram submetidas à SDS-PAGE 12% e coradas com coomasie blue. (M) Marcador de peso molecular; (1) rLIC11889; (2) rLIC10666; (3) rLIC10463; e (4) rLIC10498.    O ensaio de antigenicidade revelou que todas as proteínas expressas neste estudo reagiram com o pool de soros de pacientes convalescentes de leptospirose. Embora a caracterização da 56634 Brazilian Journal of Development Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 8, p.56629-56636 aug. 2020. ISSN 2525-8761   antigenicidade seja um passo importante durante a identificação de novos candidatos vacinais, não existe, ainda, a confirmação de uma relação direta com a amplitude da resposta imune produzida e a proteção contra a leptospirose. Um exemplo desse fato, é a proteína LipL32, a qual está exposta na superfície da bactéria, é altamente antigênica e imunogênica, mas não parece capaz de induzir imunidade protetora em modelo animal (Murray, 2013). No Brasil, assim como a América Latina, existe um grande potencial para o desenvolvimento de vacinas contra a leptospirose. Nos últimos anos, grupos de estudo vêm adotando novas estratégias para o desenvolvimento de uma vacina de amplo espectro (Dellagostin et al., 2011), tendo em vista que as vacinas disponíveis contra a leptospirose continuam sendo principalmente bacterinas inativadas pelo calor. Essas bacterinas possuem importantes limitações, incluindo a falha em prevenir a transmissão da enfermidade, já que protegem contra os antígenos presentes na preparação (Adler, 2014). Esse tipo de vacina requer o conhecimento dos principais sorovares causadores da enfermidade num determinado país ou região, para que sejam incluídas as cepas isoladas locais e aqueles sorovares mais prevalentes nos estudos sorológicos (Murray et al., 2013). Embora a imunidade contra a leptospirose seja predominantemente humoral (Balakrishnan e Roy, 2014), estudos demonstram que bovinos, por exemplo, mesmo com altos níveis de anticorpos aglutinantes, não estavam protegidos da infecção por leptospiras. Embora a transferência do soro desses bovinos para hamsters tenha induzido imunidade passiva nos roedores, a correlação da imunidade dos bovinos com a resposta Th1 medida pelo IFN-g resultou em consequências para o desenvolvimento de vacinas para essa espécie animal (Naiman et al., 2001). Durante a infecção em mamíferos, as leptospiras patogênicas expressam antígenos que se tornam alvos da resposta imune do hospedeiro. Entre esses antígenos, encontram-se proteínas conservadas entre os diferentes sorovares de Leptospira e descritas como alvos importantes para o desenvolvimento de vacinas (Gamberini et al., 2005). Desde a última década, vários alvos proteicos foram identificados como potenciais candidatos vacinais visando o desenvolvimento de uma vacina recombinante contra a leptospirose. No entanto, a grande maioria dos alvos testados não foi capaz de conferir proteção significativa em modelo animal.  4 CONCLUSÃO No presente estudo, quatro proteínas foram expressas na forma recombinante e purificadas através da cromatografia de afinidade. O ensaio de antigenicidade revelou que todas as proteínas expressas neste estudo reagiram com soros de pacientes convalescentes da leptospirose. Assim, 56635 Brazilian Journal of Development Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 8, p.56629-56636 aug. 2020. ISSN 2525-8761   essas proteínas constituem alvos potenciais para a utilização em ensaios de imunogenicidade e imunoproteção em modelo animal.  AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a CAPES, CNPq e a FAPERGS pelas bolsas de estudo e pelos demais auxílios financeiros para a execução deste trabalho. 56636 Brazilian Journal of Development Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 8, p.56629-56636 aug. 2020. ISSN 2525-8761   REFERÊNCIAS  ADLER, B. Pathogenenisis of leptospirosis: cellular and molecular aspects. Veterinary Microbiology, v.172, p.353-358, 2014.  BALAKRISHNAN, G.; ROY, P. Comparison of efficacy of two experimental bovine leptospira vaccines under laboratory and field. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.159, p.11-15, 2014.  BLANCO, R. M.; SANTOS, L. F.; GALLOWAY, R.L.; ROMERO, E. C. Is the microagglutination test (MAT) good for predictiong the infecting serogroup for leptospirosis in Brazil? 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Potencial antigênico de proteínas recombinantes de Leptospira Interrogans /  Antigenic potential of recombinant proteins from Leptospira Interrogans

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