A viabilidade econômica da produção de etanol de segunda geração (2G) depende do aproveitamento de todas as frações fermentescíveis presentes (celulose e hemicelulose) em etanol. A D-xilulose, (isômero da xilose, principal componente da hemicelulose), pode ser metabolizada pela levedura S. cerevisiae produzindo etanol e/ou xilitol, dependendo das condições de cultivo empregadas. Sendo assim, é fundamental identificar as condições de cultivo que favorecem a produção de etanol. Neste trabalho, usando o software OptFlux, foi aplicado o método “parcimonious FBA” ao modelo metabólico em escala genômica iMM904 que foi modificado neste trabalho para estimar os fluxos metabólicos utilizando xilulose como fonte de carbono. Os resultados mostram que é possível predizer os fluxos do etanol com erro de 2%, e xilitol com erro de 18%. Foi constatado que para cada fluxo diferente de xilulose existe alguma condição de oxigênio que favorece a seletividade em etanol

Menezes, Gabriel Silva De

Montano, Inti Doraci Cavalcanti

Suarez, Carlos Alberto Galeano

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BrazilianJournal of Development    Braz. J. of  Develop., Curitiba,  v. 5, n. 9, p. 15236-15241  sep. 2019      ISSN 2525-8761  15236  Adaptação do modelo metabólico IMM904 de saccharomyces cerevisiae para determinação in silico dos fluxos de produção de etanol/xilitol utilizando xilulose  Adaptation of saccharomyces cerevisiae metabolic model IMM904 for in silico determination of ethanol/xylitol production flows using xylulose  DOI:10.34117/bjdv5n9-111  Recebimento dos originais: 20/08/2019 Aceitação para publicação: 17/09/2019  Gabriel Silva De Menezes Aluno de graduação em Engenharia Química Instituição: Universidade Federal de Goiás Endereço: Avenida esperança, s/n, Campus Samambaia, Goiânia – GO, Brasil. CEP: 74690-900 E-mail: bootsuporte@hotmail.com  Carlos Alberto Galeano Suarez Doutor em Engenharia Química pela Universidade Federal de São Carlos Instituição: Universidade Federal de Goiás Endereço: Avenida esperança, s/n, Campus Samambaia, Goiânia – GO, Brasil. CEP: 74690-900 E-mail: carlogalen21@ufg.br  Inti Doraci Cavalcanti Montano Doutora em Engenharia Química pela Universidade Federal de São Carlos Instituição: Universidade Federal de Goiás Endereço: Avenida esperança, s/n, Campus Samambaia, Goiânia – GO, Brasil. CEP: 74690-900 E-mail: inti@ufg.br  RESUMO   A viabilidade econômica da produção de etanol de segunda geração (2G) depende do aproveitamento de todas as frações fermentescíveis presentes (celulose e hemicelulose) em etanol. A D-xilulose, (isômero da xilose, principal componente da hemicelulose), pode ser metabolizada pela levedura S. cerevisiae produzindo etanol e/ou xilitol, dependendo das condições de cultivo empregadas. Sendo assim, é fundamental identificar as condições de cultivo que favorecem a produção de etanol. Neste trabalho, usando o software OptFlux, foi aplicado o método “parcimonious FBA” ao modelo metabólico em escala genômica iMM904 que foi modificado neste trabalho para estimar os fluxos metabólicos utilizando xilulose como fonte de carbono. Os resultados mostram que é possível predizer os fluxos do etanol com erro de 2%, e xilitol com erro de 18%. Foi constatado que para cada fluxo diferente de xilulose existe alguma condição de oxigênio que favorece a seletividade em etanol.  BrazilianJournal of Development    Braz. J. of  Develop., Curitiba,  v. 5, n. 9, p. 15236-15241  sep. 2019      ISSN 2525-8761  15237  Palavras-chave: OptFlux, etanol 2G, parcimonious FBA, hemicelulose.  ABSTRACT   The economic viability of the production of second generation (2G) ethanol depends on the utilization of all fermentable fractions present (cellulose and hemicellulose) in ethanol. D-xylulose (xylose isomer, main component of hemicellulose) can be metabolized by S. cerevisiae yeast to produce ethanol and / or xylitol, depending on the cultivation conditions employed. Thus, it is essential to identify the cultivation conditions that favor the production of ethanol. In this work, using OptFlux software, the “parcimonious FBA” method was applied to the iMM904 genomic scale metabolic model which was modified in this work to estimate metabolic fluxes using xylulose as carbon source. The results show that it is possible to predict ethanol flows with error of 2%, and xylitol with error of 18%. It was found that for each different xylulose flow there is some oxygen condition that favors the selectivity in ethanol.   Keywords: OptFlux, 2G ethanol, parcimonious FBA, hemicellulose  1. INTRODUÇÃO O etanol é considerado uma importante fonte de energia alternativa, que contribui para amenizar problemas energéticos e ambientais. Muitos estudos e investimentos estão sendo realizados a fim de melhorar o desempenho da produção de etanol. Neste sentido, a produção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos, conhecido como etanol de segunda geração (2G), vem se destacando por apresentar vantagens ambientais e econômicas. Entretanto, a viabilidade econômica desse processo depende do aproveitamento de todas as frações fermentescíveis presentes nos diferentes materiais lignocelulósicos em estudo, permitindo a conversão tanto da celulose (C6) quanto da hemicelulose (C5) em etanol. Após a etapa de hidrólise desses materiais gera-se, principalmente, glicose e xilose, respectivamente. É importante, portanto, que o microrganismo empregado na produção de etanol 2G seja capaz de metabolizar ambos os açúcares (CHENG et al., 2008). A levedura Saccharomyces cerevisiae é o principal microrganismo utilizado na produção indústria de bioetanol. Embora esta levedura não seja capaz de fermentar xilose, pode fermentar seu isômero D-xilulose, produzindo etanol e/ou xilitol, dependendo das condições de cultivo empregadas. Sendo assim, é fundamental identificar as condições de cultivo que favorecem a produção de etanol por S. cerevisiae. Neste contexto, este projeto tem como objetivo estudar o metabolismo de D-xilulose por S. cerevisiae in silico, usando o software OptFlux e o modelo metabólico em escala genômica iMM904, modificado a fim de obter os fluxos metabólicos adequados de fornecimento de substrato e oxigênio que proporcionem o melhor ajuste aos dados experimentais de cultivos de S. cerevisiae. O modelo ajustado foi utilizado para obter a melhor condição de operação para BrazilianJournal of Development    Braz. J. of  Develop., Curitiba,  v. 5, n. 9, p. 15236-15241  sep. 2019      ISSN 2525-8761  15238  favorecer a seletividade etanol/xilitol.  2. MATERIAS E MÉTODOS 2.1. MODELO METABÓLICO Para realização das experiências in silico foi utilizado o modelo  iMM904 reconstruído a partir da escala genômica, totalmente compartimentalizado, da levedura S. cerevisiae, contando com  904 genes e 1.412 reações. Todas as reações foram atribuídas a um dos oito locais celulares (espaço extracelular, citosol, mitocôndria, peroxissoma, núcleo, retículo endoplasmático, aparelho de Golgi ou vacúolo) (MO et al., 2009).   2.2. SOFTWARE Foi usado o OptFlux v3.3.3, software modular e de fonte aberta, destinado a apoiar as tarefas da engenharia metabólica in silico, permitindo o uso de modelos metabólicos estequiométricos para simulação do fenótipo de organismos de tipo selvagem e mutante, utilizando vários métodos, dentre eles o pFBA (parcimonious FBA) que trabalha no espaço de soluções ótimas do FBA, selecionando a resposta que minimiza a soma de todos os fluxos (ROCHA et al., 2010).   2.3. DADOS EXPERIMENTAIS Dados experimentais foram obtidos por CAVALCANTI-MONTANO, et al. 2013 com uma linhagem de S. cerevisiae selvagem adaptada ao crescimento em xilulose. Foi utilizado meio mínimo, contendo 5,0 g/L de KH2PO4, 2,0 g/L de MgSO4.7H2O, 1,5 g/L de uréia e 14 g/L (cultivo anaeróbio). Os dados experimentais utilizados para cálculo dos fluxos foram considerados durante a fase exponencial (9h de cultivo). Sabemos que é importante usar dados em condições pseudo-estacionárias, no entanto, não foram encontrados na literatura dados de cultivos contínuos ou mesmo em batelada alimentada usando xilulose pura (isenta de glicose e com baixa quantidade de xilose). A realização neste trabalho de experimentos contínuos ou em batelada alimentada utilizando xilulose como substrato torna-se inviável, no momento, pois o preço da xilulose é bastante elevado e a quantidade necessária para os experimentos é grande, considerando que o menor reator disponível no laboratório é de 1L. Porém, verificou-se a ocorrência de prolongada fase exponencial nos cultivos em batelada.    BrazilianJournal of Development    Braz. J. of  Develop., Curitiba,  v. 5, n. 9, p. 15236-15241  sep. 2019      ISSN 2525-8761  15239  3. RESULTADOS E DISCUSSÕES O modelo iMM904 foi construído para o metabolismo de hexoses, por tanto, para simulações do metabolismo de xilulose foi necessário fazer a inclusão de algumas reações (ver Figura 1) utilizando o editor de código fonte Notepad++.   Figura 1 – Modificações do modelo: utilização de xilulose, produção de xilitol, adição da via L-arabinose para produção de L-arabitol (quadrados). Reações subexpressadas para ajuste do modelo metabólico: XK e RPE (círculos).  O “modelo modificado sem ajuste” foi utilizado para realizar experiências in silico e os resultados foram comparados com os fluxos metabólicos obtidos experimentalmente (Tabela 1). Pode-se observar que a predição do fluxo da biomassa é bastante acertada (1,85% de erro); os fluxos de CO2 e etanol foram superiores aos dados experimentais (erro de 38% e 48,4% respetivamente) e os fluxos de xilitol (99,9% de erro) e arabitol estão abaixo dos dados esperados. Tabela 1 – Comparação de dados experimentais e simulados (anaerobiose). Condições ambientais: xilulose 0,88  mmol/gDCW.h e oxigênio 0,0  mmol/gDCW.h AJUSTE (mmol/gDCW.h) Experimental (9h) Modelo modif. (sem ajuste) Modelo modif. (ajustado) Biomassa (h1) 0,0054 0,0053 0,00083 Xilitol 0,27 0,0001 0,22 Arabitol 0,18 0,0 0,0 CO2 1,0 1,38 1,06 Etanol 0,93 1,38 0,95  BrazilianJournal of Development    Braz. J. of  Develop., Curitiba,  v. 5, n. 9, p. 15236-15241  sep. 2019      ISSN 2525-8761  15240  Com o objetivo de calibrar o modelo aos dados experimentais de etanol e xilitol foi realizado um “ajuste” utilizando uma ferramenta de Optflux para sub/sobre expressão de reações. As reações modificadas foram: subexpressão da reação de formação de xilulose 5 fosfato (XK) em 80% e subexpressão da reação de formação de ribulose 5 fosfato a partir de xilulose 5 fosfato (RPE) em 50% (ver Figura 1). Na Tabela 1 são apresentados os valores simulados do “modelo modificado ajustado”. Observou-se que os valores de CO2/etanol/xilitol ficaram mais próximos aos experimentais obtendo erros de 6 /2,15 /18 (%) respectivamente. Para produção de etanol 2G é fundamental identificar as condições de cultivo que favorecem a produção de etanol. Neste contexto, foi realizado um estudo in silico testando vários níveis de xilulose e oxigênio com o intuito de encontrar as melhores condições que favoreçam a seletividade para o etanol. A Tabela 2 mostra os resultados obtidos nas simulações de limitação de oxigênio utilizando os modelos ajustados. Para valores de oxigênio em torno de 0,05 mmol/gDW.h e xilulose de 0,78 mmol/gDW.h ouve diminuição do fluxo de xilitol, sem afetar significativamente a produção de etanol, favorecendo a seletividade em etanol. Tabela 2 –Simulações com vários níveis de oxigênio e xilulose para modelo ajustado (em mmol/gDCW.h)   ENTRADAS RESPOSTAS Fonte de C O2 Biomassa EtOH Xilitol Seletividade EtOH/Xil Xilu(-1,18)  -0,25 0,014 1,28 0,23 5,57 -0,1 0,009 1,39 0,23 6,04 -0,05 0,007 1,36 0,27 5,04 Xilu (-0,88) -0,25 0,009 0,95 0,18 5,28 -0,1 0,005 1,05 0,18 5,83 -0,05 0,003 1,07 0,18 5,94 Xilu (-0,78) -0,25 0,001 0,84 0,15 5,6 -0,1 0,003 0,94 0,16 5,9 -0,05 0,001 0,97 0,16 6,1  4. CONCLUSÕES Com o modelo anaeróbio e as modificações impostas (modelo ajustado) foram obtidos valores de etanol e xilitol muito próximos aos dados experimentais. Todavia, o modelo anaeróbio não apresentou produção de arabitol, que foi constatada experimentalmente e a taxa de biomassa caiu consideravelmente. Variações no oxigênio disponível no começo das BrazilianJournal of Development    Braz. J. of  Develop., Curitiba,  v. 5, n. 9, p. 15236-15241  sep. 2019      ISSN 2525-8761  15241  simulações apresentaram importantes variações na seletividade para etanol, valendo a pena ressaltar que a condição de oxigênio que poderíamos chamar de “ótima” muda com o fluxo de xilulose disponível.  AGRADECIMENTOS O presente trabalho foi realizado com apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq - Processo No 427572/2016-9).  REFERÊNCIAS CAVALCANTI-MONTANO ID, SUAREZ CAG, SOUSA RJr, GIORDANO RC, FERREIRA EC, ZANGIROLAMI TC e ROCHA I, Análise dos fluxos metabólicos em saccharomyces cerevisiae a partir de d-xilulose como fonte de carbono utilizando Optflux. XIX Simpósio Nacional de Bioprocessos (SINAFERM), 2013. CHENG, K. K.; CAI, B. Y.; ZHANG, J. A.; LING, H. Z.; ZHOU, Y. J.; GE, J. P.; XU, J. M. Sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate for ethanol production by acid recovery process. Biochemical Engineering Journal, v. 38, p. 105–109, 2008. MO ML, PALSSON BØ, HERRGÅRD MJ, Connecting extracellular metabolomic measurements to intracellular flux states in yeast. BMC Systems Biology, v. 3, n. 1, 2009. ROCHA I, MAIA P, EVANGELISTA P, VILACA P,  SOARES S,  PINTO JP,  NIELSEN J,  PATIL KR, FERREIRA EC, ROCHA M, OptFlux: an open-source software platform for in silico metabolic engineering. BMC Syst Biol, v. 4, p. 45, 2010. Os autores agradecem ao CNPq (Processo 427572/2016-9).  

Adaptação do modelo metabólico IMM904 de saccharomyces cerevisiae para determinação in silico dos fluxos de produção de etanol/xilitol utilizando xilulose / Adaptation of saccharomyces cerevisiae metabolic model IMM904 for in silico determination of ethanol/xylitol production flows using xylulose

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