Resumo: a hemoglobinopatia S Ã© uma das doenÃ§as hereditÃ¡rias mais prevalentes no mundo assim como no Brasil. O presente trabalho investigou a prevalÃªncia da hemoglobina S em pacientes do laboratÃ³rio clÃ­nico da PontifÃ­cia Universidade CatÃ³lica de GoiÃ¡s, utilizando a PCR-AE (Polymerase Chain Reaction â?? Alele Specific). Foi encontrada uma prevalÃªncia de 4% (1/25) para hemoglobina S.

Palavras-chave: Hemoglobinopatias. Hemoglobina S. PCR-AE

Gonçalves, Nathália Marcela Vieira

Krawczyk, Anny Morais

Moura, Kátia Karina Verolli De O.

Penna, Karlla Greick Batista Dias

Rabelo, Mariana Mariana Schwengber

Portuguese

Portal de Periódicos Científicos da PUC Goiás

estudos, Goiânia, v. 41, n. 4, p. 689-696, out./dez. 2014.689PREVALÊNCIADE HEMOGLOBINA S POR PCR-AE EM PACIENTES DO LABORATÓRIO CLÍNICO DA PUC GOIÁS*ANNY MORAIS KRAWCZYK, NATHÁLIA MARCELA VIEIRA GONÇALVES, MARIANA SCHWENGBER RABELO, KARLLA GREICK BATISTA DIAS PENNA, KÁTIA KARINA VEROLLI DE O. MOURAResumo: a hemoglobinopatia S é uma das doenças hereditárias mais preva-lentes no mundo assim como no Brasil. O presente trabalho investigou a pre-valência da hemoglobina S em pacientes do laboratório clínico da Pontifícia Universidade Católica de Goiás, utilizando a PCR-AE (Polymerase Chain Reaction – Alele Specific). Foi encontradauma prevalência de 4% (1/25) para hemoglobina S.Palavras-chave: Hemoglobinopatias. Hemoglobina S. PCR-AE.  As hemoglobinopatias são doenças muito frequentes sendo conhecidas como distúrbios hereditários da hemoglobina humana. As hemoglo-binopatias são geneticamente determinadas e apresentam morbidade significativa em todo o mundo (THOMPSON; MCINNES; WILLAD, 1993). A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que mais de 6 % da popula-ção mundial seja portadora de algum tipo de hemoglobinopatia (SOBRINHO et al., 2011). Esses distúrbios são decorrentes de alterações estruturais que dão origem as hemoglobinas variantes ou reguladoras nos genes da globina hu-mana, seja quando não há produção de cadeia e/ou quando pequenas quanti-dades de cadeias são formadas, originando as talassemias sendo que também é comum a interação destas com as hemoglobinas variantes. Essas alterações, em sua maioria, são representadas por mutações de ponto em um único nucle-otídeo, podendo ainda ser originadas por microinserções ou microdeleções, deleções ou crossing over desigual entre cromátides parentais (BERTHOLO; MOREIRA, 2006).Os tipos de hemoglobinas podem variar de acordo com as diferentes fases do desenvolvimento humano. As funções das hemoglobinas (Hb) são marcadas desde os primeiros dias de gravidez, adaptando-se ao constante de-senvolvimento do embrião e no feto, até a estabilização, seis meses após o estudos, Goiânia, v. 41, n. 4, p. 689-696, out./dez. 2014.690nascimento(PSCHEIDT et al, 2003). A síntese de globinas está sob o controle de genes distintos, separados em dois agrupamentos (clusters); os genes que codificam as ca-deias α e ζ (cluster α) estão localizados na região telomérica do braço curto do cromos-somo 16 (16p 13.3), ao passo que aqueles que codificam as cadeias β, δ, γ e ε (cluster β) estão no braço curto do cromossomo 11 (11p 15.5). No período embrionário, são produzidas as Hb embrionárias Gower I (ζ2ε2), Gower II (α2ε2) e Portland I (ζ2γ2); no período fetal, estas são substituídas pela Hb fetal ou F (α2γ2), que, por sua vez, dá lugar às Hb A (α2β2) e A2 (α2δ2) na vida adulta. Seis meses após o nascimento, a Hb A é absolutamente predominante, compondo mais de 95% do total da Hb celular, enquanto a A2 se mantém em níveis entre 2 e 3%, e a fetal entre 0 e 2% (SONATI; COSTA, 2008).Há mais de 500 tipos de hemoglobinopatias hereditárias, segundo a OMS três delas requerem implantação de programas de saúde publica no Brasil, devi-do sua capacidade de causar um grau considerável de morbidade e mortalidade se tornando um problema de saúde pública. Dentre elas estão: a hemoglobina S, hemoglobina C e a β-talassemia, sendo a hemoglobina S a mais frequente. Dados obtidos através de estudo feito na população brasileira revela que, no país há mais de 10 milhões de indivíduos heterozigotos para os genes Hb S, Hb C e da talassemia β. Em geral esses indivíduos por serem assintomáticos desconhecem tal condição e assim, facilitam a propagação e a interação destes genes anômalos com outras hemoglobinas variantes, talassemias, enzimopatias e esferocitoses (RAMALHO; MAGNA; PAIVA-E-SILVA, 2003).A hemoglobina S é caracterizada por uma mutação no gene da β-globina. A sequência nucleotídica do alelo da célula falciforme é alterada contendo uma timina (T) no lugar de uma adenina (A), alterando assim otriplete de nucleotídeos GAG para GTG essa única alteração de base resulta na hemoglobina S. Está mutação resulta na troca de aminoácidos na posição 6, a valina pelo ácido glutâmico. A valina é um aminoácido hi-drofóbico, portanto, as moléculas de hemoglobina S sem oxigênio se agrupam, formando fibras insolúveis dentro do eritrócito alterando assim a sua formaadquirindo a forma de uma foice. A doença falciforme só acontece em estados homozigóticos para Hb S, hetero-zigóticos Hb S e Hb C ou Hb S e β-talassemia, por tanto a anemia falciforme é uma doença genética recessiva. O traço falciforme é a condição heterozigótica que associa a Hb S e Hb A e não é considerada doença falciforme, indivíduos nesta condição são na maioria as-sintomáticos e o hemograma se apresenta normal (DOUDNA, COX, 2012, MANUELE; LOPES, 2006).Com a polimerização da hemoglobina S em baixas concentrações de oxigênio, o eritrócito toma a forma de uma foice, além disso, são observadas alterações associadas à membrana dos eritrócitos e nas células endoteliais. A resultante obstrução dos peque-nos vasos sanguíneos leva ao infarto tecidual, responsável pela característica clínica dominante da doença, as crises dolorosas recorrentes afetando os dedos e os tornozelos (em crianças pequenas), os membros, o abdome e tórax. Outra característica clínica é a anemia causada pela redução de vida das hemácias e a esplenomegalia, presente somente na infância. A anemia falciforme é uma doença crônica multissistêmica que leva a falência múltipla de órgãos (MANUELE; LOPES, 2006).estudos, Goiânia, v. 41, n. 4, p. 689-696, out./dez. 2014.691A hemoglobina S é originária da África, estendeu-se para a península Arábica, sul da Itália e Índia, chegando as Américas e nosso país pela imigração forçada de in-divíduos negros africanos. No Brasil a hemoglobina S se distribui heterogeneamente tendo prevalência mais acentuada onde a proporção de antepassados de raça negra é maior, como por exemplo, a região Nordeste do país. No entanto devido grande mis-cigenação que torna a população brasileira única, a hemoglobina S é encontrada tam-bém em indivíduos pardos e brancos (SALZANO, TONDO, 1982, ZAGO, JUNIOR, FRANCO, 1999).A prevalência de hemoglobina S na população negra da África Equatorial está entre 5 % a 10 %. Acredita-se que a considerável prevalência da hemoglobina S na África seja a de séculos de seleção natural, pela maior resistência de eritrócitos com hemoglobina S à infecção pelo Plasmodiumfalciparum. A prevalência da hemoglobina S no Brasil se dá pelo período da escravatura, com a miscigenação racial é possível encontrar indivíduos aparentemente brancos portadores da hemoglonina S.Em meados de 1726 iniciou-se o povoamento do que hoje é delimitado como Estado de Goiás o qual, se intensificou durante o período do Ciclo do Ouro, na era colonial. Inicialmente vieram os portugueses e os escravos africanos, favorecendo a mestiçagem entre eles. Posteriormente ocorreram as migrações internas oriundas dos estados vizinhos e outros povos, que ocorreram de forma aleatória e sem controle da entrada e saída (FAILACE; FERNANDES, 2009; MELO-REIS; NAOUM, 2006). O objetivo do presente estudo é pesquisar através da PCR-AE a prevalência de hemoglobina S em pacientes atendidos no Laboratório Clínico da Pontifícia Universi-dade Católica de Goiás.MATERIAL E MÉTODOSForam coletadas amostras de sangue em 199 pacientes atendidos no Laboratório Clinico da PUC Goiás no período de agosto/2012 a julho/2013 e apenas em 25 pacien-tes realizaram-se técnicas moleculares por indicação dos parâmetros alterados, sendo eles hematócrito, hemoglobina, contagem global de eritrócitos, volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM), concentração de hemoglobi-na corpuscular média (CHCM) e índice de anisocitose (RDW) (RABELO, 2012).Os participantes elegíveis foram encaminhados aos serviços do Laboratório Clí-nico da PUC Goiás para realização de hemograma, acima de 18 anos que assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE).Para o presente estudo, as amostras de sangue foram analisadas pela técnica es-tabelecida como padrão pela OMS, e não houve a necessidade do paciente estar em jejum. A coleta foi realizada por punção venosa em veias periféricas, diretamente em tubo a vácuo contendo solução comercial de anticoagulante ácido etilenodiamino tetra--acético (EDTA) a 10g/dl, uma gota para cada 5ml de sangue. A confirmação e quanti-ficação das hemoglobinas normais e variantes foi realizada pelo sistema automatizado de cromatografia líquida de alta performance (HPLC), com equipamento VariantBio--Rad®. Esses dois métodos foram efetuados pela mestranda responsável pelo projeto, Mariana Schwengber Rabelo (RABELO, 2012).estudos, Goiânia, v. 41, n. 4, p. 689-696, out./dez. 2014.692As amostras foram alíquotadas e armazenadas em freezer a -18ºC, etiquetados com número e encaminhadas para o Núcleo de Pesquisas Replicon (NPR) da PUC Goiás, onde foram analisadas por técnicas moleculares. A extração de DNA foi iniciada com a purificação das amostras, de acordo com as instruções do Kit GFXTM (Amersham Pharmacia Biotech®). O produto obtido foi submetido à corrida eletroforética em gel de agarose em um campo elétrico de 100 V/cm e corado com brometo de etídio (5μg/mL) sendo visualizado em seguida no VDS (Video Documentation spectral).Na determinação genotípica foi ultilizado 2 tubos para cada amostra de DNA para um volume final de 100 uL de reação, acrescentando 20 mmol/L de tampão, 0,2 mmol/L de cada dNTP; 1,5 mmol/L de MgCl2; 1,25 U de Taq DNA polimerase (Gib-co-BRL); 50,0 a 100,0 ng de DNA genômico e 0,2 mmol/L de cada primer, sendo no tubo 1 adicionados os primersBeta 5’-a, Beta 5’-b e Beta A-b; no tubo 2 primersBeta 5’-a, Beta 5’-b e Beta S-b. O processo de amplificação foi realizado por uma desnatu-ração prévia de 95ºC por 5 minutos, acrescida de 35 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 55ºC 1 minuto, 65ºC por 2 minutos seguida de uma extensão final a 65ºC por 5 minutos. A análise dos produtos foi verificada em gel de agarose a 2% (RABELO, 2012).RESULTADOSDos 199 pacientes analisados no período de agosto/2012 a julho/2013, apenas 25 foram selecionados para a realização das técnicas moleculares. Na tabela 1, foram demonstrados os resultados da PCR nos 25 pacientes selecio-nados para estudo do perfil molecular. Tabela 1: Genótipo da hemoglobina AA, AS ou SS realizado por PCR-Alelo Específica.Genótipos A/A A/S S/SPacientes 24 1 0% 96 4 0No perfil da análise molecular foi encontrada uma frequência de 96% (24) do genótipo A/A e 4% (1) do genótipo A/S e 0% do genótipo S/S, entre os 25 pacientes estudados.Dos 25 pacientes estudados para análise molecular, foi verificada a presença de 4%(1/25) para Hemoglobina SDISCUSSÃOA PCR-AE permite a distinção entre alelos que diferem um único nucleotídeo, isto é, detecta mutações pontuais especificas a tornando muito útil no diagnostico de hemoglobinopatias (BERTHOLO; MOREIRA, 2006).A confirmação da base molecular das hemoglobinopatias é importante para uma melhor abordagem terapêutica e evitar morbidade e mortalidade no caso de indivíduos estudos, Goiânia, v. 41, n. 4, p. 689-696, out./dez. 2014.693homozigotos. Para os indivíduos heterozigotos a confirmação molecular de uma hemo-globinopatia, por exemplo, a hemoglobina S ou traço falcêmico tem papel importante no aconselhamento genético de casais heterozigotos (RAMALHO; MAGNA, 2007).O resultado do nosso estudo, pela análise molecular está de acordo com outros estudos realizados como o da Universidade Estadual de São Paulo, de São José do Rio Preto, por ORLADO (2000) e colaboradores, das 262 amostras analisadas em doado-res de sangue, 4,96% (13/262) apresentaram hemoglobinas anormais, dentre, 0,76% (2/262) com Hb AS. Nesse mesmo trabalho, constatou-se que, das 112 amostras ana-lisadas em estudantes, 25% (28/112) apresentaram hemoglobinas anormais e desses, 0,89% (1/112) com Hb AS.Também LISOT (2004) e colaboradores, estudaram aproximadamente 9 mil pes-soas que doaram sangue entre abril e dezembro de 2001, em Caxias do Sul-RS. Dentre essas amostras, 864 foram randomicamente sorteadas, e 70,40% (608/864) aceitaram participar do estudo. Na população participante, foram encontrados 11,68% (71/864) indivíduos afetados, desses, 0,99% (6/864) tinha genótipo AS.Porém, diferentedos nossos resultados, na Maternidade-Escola Assis Chateau-briand em Fortaleza-CE a prevalência da Hb S em recém-nascidos, dos 389 pacientes analisados, foi de 4,1% (11/389). Outro estudo, feito por Nicolato (2010) e colabo-radores, esse em Ouro Preto-MG, no qual foram triados 943 pacientes de ambos os sexos e diferentes faixas etárias, a prevalência de hemoglobina S encontrada foi de 4,88%. No trabalho realizado em 590 recém-nascidos na maternidade Tysila Balbino em Salvador-BA, ADORNO (2005) e colaboradores, o percentual de hemoglobina S encontrado foi de 10% (58). Assim como o relato de Elizano Santos de Assis, que estudou as síndromes falcêmicas em uma população quilombola em Aracaju-SE, os valores variáveis de prevalência de hemoglobina S foram entre 24,9 a 37,9%. Outro estudo realizado no Equador para verificar a prevalência de hemoglobina na população afrodescendente do Equador em um grupo de 144 pacientes de ambos os sexos e faixa etária de 16 a 81 anos, a hemoglobina variante mais frequente foi à hemoglobina S, atingindo 14% do grupo estudado por DOMÍNGUEZ (2013).No mundo, a prevalência da hemoglobina S nas populações é muito variável devido a historia de colonização e características genéticas e raciais de cada região em estudo. Este fato explica que um mesmo estudo de prevalência da hemoglobina S feito em regiões diferentes de um mesmo país, podem ter resultados distintos ou semelhan-tes entre si (NOAUM, 1982).CONCLUSÃONa população de estudo, a prevalência para hemoglobina S foi de 4% em hetero-zigose. Não foi encontrado, em nenhuma das amostras analisadas, nenhum indivíduo homozigoto para hemoglobina S. Os resultados encontrados foram semelhantes aos trabalhos realizados nos estados de São Paulo e Rio Grande do Sul, porém, a prevalên-cia encontrada se diferencia da maior parte dos estudos nessa área. Isso nos mostra que a entrada de imigrantes ao longo da história do Brasil e com a intensa mistura racial, os estudos, Goiânia, v. 41, n. 4, p. 689-696, out./dez. 2014.694genes responsáveis pelas hemoglobinopatias se estabeleceram na população brasileira. Essa diversidade racial implica a necessidade e a importância de realizar mais estudos nessa área.PREVALENCE OF HEMOGLOBIN S BY PCR-AE IN PATIENTS CLINICAL LABORATORY PUC GOIÁSAbstract: the S hemoglobinis one of the most prevalent hereditary diseases in the world as well as in Brazil. This study investigated the prevalence of S hemoglobin in pa-tients in the clinical laboratory at the Pontific Catholic University of Goiás, using the AE-PCR (Polymerase Chain Reaction-Specific Alele). A prevalence of 4% (1/25) was found for hemoglobin S.Keywords: Hemoglobinopathy. Hemoglobin S. PCR-AE.Referências ADORNO et al., Hemoglobinopatias em recém-nascidos de Salvador, Bahia, Nordeste do Brasil. Caderno de Saúde Pública, Rio de Janeiro, p. 292-298, 2005.ASSIS, E. S. de; OLIVEIRA, C. C. da C.; REIS, F. P. Estudo das síndromes falcêmica sem comunidade quilombola, Sergipe / Brasil. Dissertação (Mestrado) p. 58, 2010.BERTHOLO, L. C.; MOREIRA, H. W. Amplificação gênica alelo-específica na ca-racterização das hemoglobinas S, C e D e as interações entre elas e talassemias beta. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, p. 245–251, 2006. DOMÍNGUEZ, Y. et al., Prevalence of common hemoglobin variants in an afro-des-cendent Ecuadorian population. BMC Research Notes, 2013. DOUDNA, J. A.; COX, M. M. Biologia Molecular - Princípios e Técnicas. p. 944, 2012.FAILACE, R. et al., Anemias Hemoliticas. Hemograma: Manual de interpretação. 5 ed. p. 121-145, 2009.LISOT, C. L.; SILLA, L. M. Triagem de hemoglobinopatias em doadores de sangue de Caxias do Sul, Rio Grande do Sul, Brasil: prevalência em área de colonização italiana. Caderno de Saúde Pública, Rio de Janeiro, v. 20, n. 6, p. 1595-1601, nov./dez. 2004.MANUELE; LOPES, A. C. Diagnostico é tratamento, v. 2, p. 887-890, 2006. MELO-REIS, P. R. de; NAOUM, P. C. Prevalência de talassemias e hemoglobinas variantes no estado de Goiás, Brasil. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Labo-ratorial, p. 425-430, 2006. NAOUM, P. C. Hemoglobinopatias no Estado de São Paulo. Métodos de Estudos, Pre-valência, Distribuição Geográfica, e Relações Históricas e Antropológicas. São José do Rio Preto-SP, p. 279, 1982.NICOLATO, R. L. D. C.; CARNEIRO, C. M.; PAULA, C. A. de. Avaliação da inci-dência de hemoglobinopatias em pacientes atendidos no Laboratório Piloto de Aná-lises Clínicas da Escola de Farmácia - UFOP. Dissertação (Mestrado) - Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto, p. 53, 2010.PSCHEIDT, S. et al., Köln’s unstable hemoglobin: case report and literature review. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, p. 37-40, 2003.estudos, Goiânia, v. 41, n. 4, p. 689-696, out./dez. 2014.695RABELO, M. S. Caracterização Molecular de Hemoglobinopatias em Pacientes do Laboratório Clínico da PUC Goiás. Dissertação (Mestrado em Génetica) - Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Goiânia, 2012.RAMALHO, A. S.; MAGNA, L. A. Aconselhamento genético do paciente com doença falciforme. Revista brasileirade hematologia e hemoterapia, p. 229-232, 2007. RAMALHO, A. S.; MAGNA, L. A.; PAIVA-E-SILVA, R. B. de. A Portaria no 822/01 do Ministério da Saúde e as peculiaridades das hemoglobinopatias em saúde pública no Brasil. Caderno de Saúde Pública, Rio de Janeiro, p. 1195-1199, 2003. SALZANO, F. M.; TONDO, C. V. Hemoglobin Types in Braziliak Populations. Mis-cellaneous Article, p. 85-97, 1982. SOBRINHO, E. F. A. et al., Manifestações retinianas em pacientes portadores de ane-mia de células falciformes. Revista Brasileira de Oftalmologia, p. 284-9, 2011.SONATI, M. de F.; COSTA, F. F. The genetics of blood disorders: hereditary hemoglo-binopathies. Jornal de Pediatria, p. s40-51, 2008.THOMPSON, M. W.; MCINNES, R. R.; WILLAD, H. Genética médica, 5. ed. 1993. ZAGO, M. A.; JUNIOR, W. A. S.; FRANCO, R. F. Hemoglobinopathies and other hereditary hematological diseases in the brazilian population. Ciênc. cult. (Säo Paulo), p. 226-34, 1999. * Recebido em: 10.09.2014 . Aprovado em: 20.09.2014.ANNY MORAIS KRAWCZYK, NATHÁLIA MARCELA VIEIRA GONÇALVESAcadêmicas do 9º período do Curso de Biomedicina da Pontifícia Universidade Ca-tólica de Goiás (PUC Goiás). E-mail: moraiskrawczyk@gmail.com; nathaviegon@gmail.com.MARIANA SCHWENGBER RABELOBiomédica, mestranda MGENE, PUC Goiás. KARLLA GREICK BATISTA DIAS PENNABiomédica, Professora Doutora adjunta CBB/PUC Goiás. E-mail: karllagreick@yahoo.com.brKÁTIA KARINA VEROLLI DE O. MOURA Biomédica, Professora Doutora adjunta CBB/PUC Goiás. E-mail: kkverolli@pu-cgoias.edu.br.

PREVALÃ?NCIA DE HEMOGLOBINA S POR PCR-AE EM PACIENTES DO LABORATÃ?RIO CLÃNICO DA PUC GOIÃS

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