Characterization of a vaccine composed of dendritic cells. Study of the mechanism of action conferring protection against murine B16F1 melanoma

Abstract

Se caracterizaron de forma fenotípica y funcional las células dendríticas (CD)derivadas del cultivo de precursores de médula ósea, y se estudió el mecanismomediante el cual la vacuna CD/Apo-Nec, constituida por CD co-cultivadas con célulasapoptóticas y necróticas del melanoma murino B16F1 (Apo-Nec), genera protecciónanti-tumoral. Las CD se separaron empleando microesferas magnéticas anti-CD11c, y lasdos poblaciones resultantes en términos de positividad para CD11c (CD+ y CD-),se estudiaron junto a las CD. Se demostró que la población de CD obtenida luego de 7 días de cultivo con elfactor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos murino (mGM-CSF), esheterogénea y presenta aproximadamente un 60% de CD CD11c+. El 26,6% de lascélulas presentes en la fracción CD+ co-expresó los antígenos de superficie CD11c y F4/80, y el 75,4% resultó ser doble positiva para CD11c y CD11b. La fracción CD+también expresó Ly6-G. La fracción CD- quedó enriquecida en macrófagos CD11c-/F4/80+ (44,7%), algunos de los cuales co-expresaron Ly6G (41,8%); y en neutrófilos F4/80-/Ly6-G+(34,6%). Las fracciones CD+ y CD- mostraron una capacidad similar para fagocitar yendocitar antígenos, y expresaron niveles similares de moléculas del complejo mayorde histocompatibilidad de tipo II y moléculas co-estimulatorias CD80, CD83 y CD86,respecto a la población de CD. Sin embargo, sólo la vacuna CD/Apo-Nec fue capaz deconferir una protección significativa. Luego del co-cultivo no se detectó interleuquina-12,ni intracelularmente ni en el sobrenadante de la vacuna CD/Apo-Nec. Por lo cual,la protección obtenida sería independiente de su habilidad para secretar esta citoquinaen el momento de ser administrada. No detectamos una polarización de los macrófagos y neutrófilos derivados delcultivo de CD hacia un fenotipo M1/N1 o M2/N2, antes o después del co-cultivo, lo cualpodría relacionarse con la falta de expresión de interferón-γ, y de secreción deinterleuquina-10 e interleuquina-12 por parte de las células. Las vacunas constituidas por las fracciones CD+ y CD-(CD+/Apo-Nec y CD-/Apo-Nec),indujeron en los sitios de inmunización, la expresión de interleuquina-10 y una elevada producción de óxido nítrico, lo cual podría explicar en parte suincapacidad para conferir protección anti-tumoral. Los resultados obtenidos indicarían que existe una interacción entre laspoblaciones celulares que conforman el cultivo de CD. Variaciones en el número dedichas poblaciones resultarían en la falta de protección; por lo cual todas las célulaspresentes en la vacuna CD/Apo-Nec serían necesarias para inducir protección contrael melanoma murino B16-F1.Dendritic cells (DC) were derived from murine bone marrow precursors,phenotipically and functionally characterized and used to describe the mechanism bywhich the CD/Apo-Nec vaccine, comprising DC co-cultured with apoptotic and necroticcells from murine B16F1 melanoma (Apo-Nec), induces anti-tumoral protection. DC were separated with anti-CD11c microbeads and the two populationsidentified in terms of CD11c positivity (DC+ and DC-) were also studied. The population of DC obtained after 7 days of culture with murine granulocyteand macrophage colony stimulating factor (mGM-CSF), was shown to beheterogeneous, comprising about 60% CD11c+ DC. 26.6% of the cells in the DC+fraction co-expressed CD11c+ and F4/80 markers and 75.4% of the DC+ fraction werepositive for both CD11c and CD11b markers. The DC+ fraction also expressed Ly6G. The DC- fraction was richer in CD11c/F4/80+ macrophages (44.7%), some of which coexpressed Ly6G (41.8%), and F4/80-/Ly6-G+ neutrophils (34.6%). The DC+ and DC- fractionsdisplayed similar capacities to phagocyte and endocyte antigens and evenexpressed levels of the major histocompatibility complex class II and the costimulatorymolecules CD80, CD83 and CD86 similar to those found in the DC fraction. However,only DC/ApoNec vaccine was capable to induce significant protection. After co-culture,no detectable level of IL-12 was recorded in DC/ApoNec vaccine, either in supernatantor intracellularly. Therefore, the protection obtained seemed to be independent of thevaccine’s ability to secrete this cytokine at the time of injection. The macrophages and neutrophils derived from the DC culture did not polarizedtoward a phenotype M1/N1 or M2/N2, before or after the co-culture, which could berelated with the lack of expression of interferon-γ, and secretion of interleukin-10 andinterleukin-12 by the cells. The vaccines composed of DC+ or DC- fractions (DC+/Apo-Nec and DC-/ApoNec),induced the expression of interleukin-10 and an elevated production of nitricoxide in the immunization sites, which could explain in part, their inability to confer antitumoral protection. These results indicate a sinergy between the cell populations that make up the DC culture. Variations in the relative size of these populations could prevent anti-tumoral protection. Thus all of the cell types present in the DC/Apo-Nec vaccine arenecessary to induce protection against murine B16F1 melanoma.Fil: Campisano, Sabrina Edith. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina