Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Abstract
La síntesis de novo de colesterol y su enzima limitante, hidroximetilglutaril-coenzima A reductasa (HMGCR), es crítica para la regulación de la proliferación y la supervivencia celular en cáncer. El objetivo general del presente trabajo es estudiar el papel de la vía del colesterol en la adquisición de propiedades de células madre en modelos de cáncer de mama (CM). Con ese propósito, se analizaron bases de datos públicas, compiladas de pacientes con CM, mediante una herramienta bioinformática online (SurvExpress; Tecnológico de Monterrey, México). Los resultados muestran que la alta expresión de varias enzimas involucradas en la síntesis del colesterol, incluyendo a: hidroximetilglutaril-CoA sintasa 1 (HMGCS1), HMGCR, mevalonato quinasa (MVK), farnesil pirofostato sintasa (FDPS) y escualeno monooxigenasa (SQLE), está significativamente asociada con menor sobrevida libre de enfermedad. Adicionalmente, la herramienta bioinformática online CellMiner (Instituto Nacional del Cáncer de los Estados Unidos) que integra datos de expresión génica y farmacológicos provenientes del panel de líneas celulares NCI-60, indica que HMGCR se expresa en varios tipos de tumores, incluyendo CM. Estos datos se validaron experimentalmente por qRT-PCR. Para evaluar si existe una asociación entre la expresión de HMGCR y características de células madre, se desarrolló un modelo de sobreexpresión de HMGCR en la línea celular MCF-7 utilizando un sistema CRISPR activador (CRISPRon). La generación de dicho sistema comprendió las siguientes etapas: 1-diseño y síntesis de las sondas (sgRNAs); 2-clonación de las sondas; 3-transformación de bacterias con los plásmidos clonados; 4-verificación de dichas construcciones por secuenciación; 5- transfección de líneas celulares; 6-caracterización del sistema. La expresión de HMGCR aumenta significativamente en las células MCF-7/CR en comparación al control de transfección (MCF-7/TC) y se observan niveles similares a los detectados en otros modelos de células madre (normales y tumorales). El fenotipo HMGCRon se asocia a un incremento de los niveles de los marcadores de pluripotencia Nanog y Sox2, un aumento en la población CD44+/CD24- y CD133+ [fórmula aproximada, revisar la misma en el original] y un aumento en la frecuencia de formación de mamoesferas, características asociadas a células madre tumorales (CMTs) en CM. A continuación, se evaluó la respuesta de líneas celulares de CM con distintos niveles de HMGCR al tratamiento con las estatinas simvastatina (SIM) y lovastatina (LOVA). Los resultados muestran una mayor sensibilidad en las líneas basales Hs578T y MDA-MB-231 (CM humano triple negativo) en comparación con las líneas luminales MCF-7 y T47D [CM humano, receptor de estrógeno (ER) y progesterona (PR) positivo, receptor del factor de crecimiento epidérmico HER2/neu negativo], que son más resistentes. Estos datos fueron corroborados con la herramienta CellMiner. Sin embargo, la línea T47D que expresa altos niveles de HMGCR es más sensible a SIM que MCF-7, indicando que en un contexto ER positivo, la sensibilidad a estatinas podría estar parcialmente determinada por HMGCR. Esto se corroboró en el sistema HMGCRon, ya que las células MCF-7/CR muestran mayor sensibilidad a SIM que la línea control MCF-7/TC. Estos datos sugieren que la expresión de HMGCR está asociada a características de CMTs y determina, al menos en parte, la sensibilidad a estatinas, sentando las bases para estudios posteriores orientados a una terapéutica anti-colesterol específica para el compartimiento de células madre en CM.The de novo synthesis of cholesterol, and its rate-limiting enzyme, hydroxymethylglutharyl-coenzyme A reductase (HMGCR), is deregulated in tumors and critical for tumor cell survival and proliferation. However, the role of HMGCR in the induction and maintenance of stemness in both transformed and non-transformed cells is still unclear. First, we analyzed public compiled databases from breast cancer (BC) patients with the web application SurvExpress from the Tecnológico de Monterrey, México. We found that high expression levels of several members of the mevalonate (MVA) pathway, including hydroxymethylglutharyl-coenzyme A synthase 1 (HMGCS1), HMGCR, mevalonate kinase (MVK), Farnesyl pyrophosphate synthase (FDPS) and squalene monooxygenase (SQLE), were associated with a lower recurrence-free survival. The web application Cell Miner from the National Cancer Institute from the United States (NCI), that allows the integration of genomic and pharmacological data, showed that HMGCR is expressed in several cancer cell lines, including BC. These data were further validated by qRT-PCR in a breast cancer cell line panel. With the purpose of endogenously increasing HMGCR expression levels, we took advantage of the system CRISPR/on, which includes small guide RNA (sgRNA) expression vectors (pSPgRNA) and the plasmid carrying the sequence for dCas9-VP160. Briefly, these steps were followed for the development of an HMGCRon system: 1-sgRNAs design and synthesis; 2-sgRNAs cloning; 3-bacteria transformation with the constructs carrying the sgRNAs; 4-validation of the constructs by sequencing; 5-transfection of the cell line MCF-7; 6-characterization of the system. The CRISPRon system significantly increased HMGCR total levels in MCF-7 cells (MCF-7/CR) when compared to transfection controls (MCF-7/TC), and were similar to those observed in other stem cell lines, both transformed and non-transformed. Additionally, the induction of an HMGCRon phenotype increased the pluripotency markers Nanog and Sox2, cancer stem cell traits such as the CD44+/CD24 low/- and the CD133+ [fórmula aproximada, revisar la misma en el original] populations and the formation of mammospheres. Next, we assessed the sensitivity of BC-derived cell lines expressing different levels of HMGCR to the statins simvastatin (SIM) and lovastatin (LOVA). Hs578T cells and MDA-MB-231 (triple negative human BC cell lines) were sensitive to both drugs, whereas MCF-7 and T47D [Estrogen Receptor (ER) and Progesterone Receptor (PR) negative, human epidermal growth factor 2 (HER2/neu) negative] cells were more resistant. These data was also confirmed with the CellMiner tool. Interestingly, T47D cells, which express high levels of HMGCR, were more sensitive to SIM than MCF-7 cells, suggesting that in ER-positive cells HMCGR would be, at least in part, determining the sensitivity towards statins. This was further corroborated since the induction of an HMGCRon phenotype in MCF-7 cells increased the sensitivity to SIM. Altogether, these data suggest that expression of HMGCR is associated with stem cell traits in BC and determines sensitivity to statin in some cases, encouraging further studies of the use of anti-cholesterol drugs as therapies to target the stem compartment of the tumor.Fil: Marks, María Paula. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
