Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Abstract
Las especies del género Lotus (Fabaceae) se encuentran dentro de las leguminosas forrajeras más cultivadas mundialmente, luego de Medicago spp. y Trifolium spp. Su alto valor nutricional y su capacidad para adaptarse a diferentes condiciones ambientales han favorecido su utilización en sistemas ganaderos ubicados en áreas marginales para la agricultura. Sin embargo, la producción de materia seca y capacidad de rebrote de Lotus spp., al igual que lo observado en otras leguminosas forrajeras, se ven drásticamente reducidas durante las estaciones frías. Con el objetivo de estudiar el efecto del estrés por bajas temperaturas en el género Lotus, se evaluó la respuesta bioquímica, transcripcional y fisiológica de diferentes ecotipos de la especie modelo L. japonicus cultivados bajo estas condiciones de estrés. En particular, estos estudios fueron profundizados en los ecotipos MG-1 y MG-20, seleccionados por su respuesta contrastante durante la germinación en frio. Metabólicamente se observó una alteración en el contenido de poliaminas en las plantas tratadas, siendo los niveles de putrescina más elevados en el ecotipo tolerante (MG-20) en comparación con el ecotipo sensible (MG-1). Se realizaron estudios mediante el agregado exógeno de la diamina putrescina en L. japonicus MG-1, y también se evaluó la respuesta de la línea transgénica pRD29A:oatADC (acumuladora de putrescina bajo condiciones de estrés) de L. tenuis en estrés por frío. Mediante estos ensayos, si bien no se logró determinar el rol de la putrescina en los mecanismos de respuesta a las bajas temperaturas de Lotus spp., se observó que el nivel de este metabolito podría utilizarse como indicador de tolerancia bajo estas condiciones en L. japonicus. A nivel transcripcional, se clasificaron 1.077 genes diferencialmente expresados al comparar plantas cultivadas bajo condiciones óptimas con respecto a plantas tratadas. Este perfil transcriptómico permitió identificar diferentes vías metabólicas involucradas en la aclimatación al frío, que fueron evaluadas en la respuesta de los ecotipos MG-1 y MG-20 de L. japonicus. Los resultados obtenidos evidenciaron una alteración en la relación NADPH/NADP+, sugiriendo un desbalance redox inducido por el frío. A su vez, se determinóla actividad de diferentes enzimas antioxidantes, observándose contrastes entre ecotipos y tratamientos para la superóxido dismutasa, en particular, en la isoforma cloroplástica. A nivel fisiológico, el estrés por frío provocó fotoinhibición en ambos ecotipos, sin embargo las plantas MG-1 se vieron más afectadas que las MG-20. Nuestros resultados sugieren que los niveles de la proteína D2 del fotosistema II (PSII) estarían involucrados en este proceso. Por último, con el objetivo de profundizar en el estudio de la fotoinhibición en L. japonicus sometido a estrés por frío, se realizó un estudio del perfil de proteínas cloroplásticas en MG-1 y MG-20. Los cambios observados en sus abundancias relativas confirman una respuesta de aclimatación diferente entre ambos ecotipos. El presente trabajo de tesis permitió identificar distintos mecanismos implicados en la aclimatación al frío en L. japonicus, en los cuáles la respuesta de los cloroplastos se encontraría fuertemente vinculada. Nuestros resultados abren la posibilidad de futuros estudios y aplicaciones en otras especies de Lotus utilizadas actualmente como forrajes.Lotus spp. are within the more cultivated forage legumes after Medicago spp. and Trifolium spp. Its high nutritional value and adaptability to marginal conditions have favored its use in areas of low agricultural suitability. However, the dry matter production and regrowth rate of cultivable Lotus spp. is drastically reduced during colder seasons. With the aim of studying the effect of cold stress in the Lotus genus, the biochemical, transcriptomic and physiological response was evaluated on different L. japonicus ecotypes under these conditions. In particular, these studies were deepened in the MG-1 and MG-20 ecotypes, obtained from their contrasting germination capacity at low temperatures. Alterations in the polyamines metabolism were observed in the treated plants, showing higher putrescine levels in the tolerant ecotype (MG-20) in comparison with the sensible ecotype (MG-1). Studies with exogenous putrescine aggregation in MG-1 L. japonicus ecotype, and transgenic pRD29A:oatADC L. tenuis (which accumulates putrescine under stress conditions) were done under chilling. Although it was not possible to determine a putrescine role in the cold response, data suggest that this metabolite could be used as a tolerance indicator under these constraint conditions in L. japonicus. High-throughput RNA sequencing was used to classify 1077 differentially expressed genes when comparing plants grown under optimal and cold stress conditions. Candidate metabolisms involved in the acclimation response to low temperatures were identified, which were further evaluated in the contrasting ecotypes MG-1 and MG-20. Data showed that a chilling-induced redox imbalance was suggested through NADPH/NADP+ ratio alterations. Antioxidant enzyme activities were also measured anddifferences were observed between ecotypes and treatments for superoxide dismutase, in particular the chloroplastic isoform. Stress-induced photoinhibition also differentially influenced both ecotypes, being MG-1 more affected than MG-20. Our results suggest that the D2 photosystem II (PSII) protein levels are involved in this phenomenon. Finally, in order to further understand the photoinhibitory process of L. japonicus under cold stress, a chloroplast protein profile was made in both MG-1 and MG-20 plants. The observed changes in their relative abundances confirm a different acclimation response between ecotypes. The present work allowed the identification of different mechanisms implicated in the cold acclimation of L. japonicus, in which the chloroplasts response would be strongly linked. Our results open the possibility for future studies and applications in other Lotus species used as forage.Fil: Calzadilla, Pablo Ignacio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
