Rôle délétère de CD38 dans la myopathie de Duchenne et bénéfices thérapeutiques de son inhibition

Abstract

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common rare disease, affecting about one in 3500 newborn boys in the world. This genetic disease originates from the loss of function of a gene carried by the X chromosome, encoding dystrophin, a protein of the subsarcolemmal cytoskeleton complex. Dystrophin is normally expressed in all muscle types and its absence leads to membrane fragility. The disease is manifested by progressive degeneration of skeletal, smooth and cardiac muscles, which leads to the patient death at about 30 years of age, due to cardiac or respiratory failure.Two major consequences of the absence of dystrophin are a muscular abnormal high cytoplasmic Ca2+ concentration linked to an excessive ryanodine receptors activation, and a deficit in cellular NAD+ levels leading to impaired energetic metabolism. This Ca2+ dysregulation will induce many pathophysiological Ca2+-dependent processes which, coupled with energetic impairment, leads to muscle cells necrosis or apoptosis.Interestingly, the enzyme CD38, is an important NAD+ consumer through its production of two-second messengers, namely NAADP and cyclic ADPR, known to be positive modulators of ryanodine receptors. Actually, CD38 contribution to DMD pathophysiology is not known. We hypothesized that CD38 activity could be deleterious in this pathology, and thus that its inhibition could be beneficial in DMD.We performed experiments in the mdx mouse, which is the main DMD rodent model. The first highlight of our study is that CD38 is actually more expressed and more active in the mdx mouse compared to WT, showing its high potential as therapeutic target in DMD. We then performed as proof of concept pharmacological experiments with a CD38 inhibitor. We found that mdx mice treated displayed endurance (grid time) and strength (grip test) restored to normal values. In order to study the long term role of CD38 in the mdx mouse, we then generated double mutant by crossing mdx mice with CD38-/- mice. We first evaluated the impact of CD38 on NAD+ consumption, by measuring NAD+ levels in various muscle tissues in mdx and in mdx/CD38-/-mice. Our data showed a dramatic deficit of NAD+ levels in all muscles extracted from mdx mice, whereas NAD+ levels were fully restored to normal values in mdx/CD38-/-mice. We also observed a considerable reduction in the pathological spontaneous Ca2+ activity in cardiomyocytes extracted from mdx/CD38-/- mice, associated with a normalization of RyR sensitivity. To further evaluate the beneficial effects of targeting CD38 in DMD, we then measured key histological and functional parameters in the mdx/CD38-/- mouse. The data obtained in mdx/CD38-/- mice demonstrated that deletion of CD38 in mdx mice strongly improves the structural and functional phenotype since we have a clear reduction in the onset of fibrosis and a very significant improvement of skeletal and respiratory function and a full recovery of the cardiac function. Finally, we show that deleting CD38 in mdx mice also prevented isoproterenol-induced heart failure and hypertrophy, a protocol which simulates the onset of cardiomyopathy in DMD patients.All these data strongly support the hypothesis that CD38 is a major contributor of the DMD phenotype and that a reduction in CD38 activity could prevent or delay the cellular damages resulting from both a deficit in NAD+ levels and a disruption of Ca2+ homeostasis in DMD. Last but not least, our study shows that the treatment of human myotubes derived from DMD patient with an anti-CD38 antibody reduces excessive Ca2+ release in these cells. This result strongly suggest that our innovative strategy could be rapidly applied in DMD patients, thanks to the recent development of human therapeutic anti-CD38 antibodies.La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique touchant le gène DMD sur le chromosome X, entraînant l'absence d'une protéine du cytosquelette : la dystrophine. Son incidence à la naissance est d’environ un nouveau-né sur 3500 garçons. La dystrophine étant normalement exprimée dans tous les types musculaires, son absence se manifeste par une dégénérescence progressive des muscles squelettiques, lisses et cardiaque, conduisant au décès du patient vers l'âge de 30 ans par insuffisance cardiaque ou respiratoire.Deux caractéristiques majeures de la DMD sont, d'une part, une concentration calcique cytoplasmique anormalement élevée, liée notamment à une activation excessive des récepteurs à la ryanodine (RyRs) et, d'autre part, un déficit en NAD+ entraînant une altération du métabolisme énergétique. Cette dérégulation majeure de l’homéostasie calcique, couplée au déficit énergétique, conduisent in fine à la mort cellulaire.L'enzyme CD38 est justement un consommateur important de NAD+, afin de produire deux seconds messagers, le NAADP et l'ADPR cyclique, connus pour être des modulateurs positifs des RyRs. Le rôle de CD38 n’étant pas connu dans la DMD, et son activité pouvant être délétère dans cette pathologie, nous avons donc émis l'hypothèse que son inhibition pourrait être bénéfique sur ces deux aspects importants de la pathologie.Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons réalisé plusieurs expériences chez la souris mdx, le modèle murin de la DMD. Tout d’abord, notre étude montre que CD38 est plus exprimée et plus active chez la souris mdx que chez la souris WT, renforçant ainsi l’intérêt de la cibler dans la DMD. Afin de tester le potentiel thérapeutique de notre stratégie, nous avons traités des souris mdx avec un inhibiteur de CD38. Chez les souris traitées, l’endurance est améliorée et la force musculaire restaurée. Afin d’approfondir le rôle de CD38 chez la souris mdx sur le long terme, nous avons ensuite généré un double mutant en croisant des souris mdx avec des souris CD38-/-. Nous avons d'abord évalué l'impact de CD38 sur la consommation de NAD+, en mesurant les taux de NAD+ dans différents muscles : nos résultats montrent un déficit majeur de NAD+ dans tous les tissus de souris mdx, et une restauration à des valeurs normales chez la souris mdx/CD38-/-. Nous observons également une réduction considérable de l'activité calcique spontanée dans les cardiomyocytes de souris mdx/CD38-/-, associée à une normalisation de la sensibilité des RyRs dans ces cellules. Pour étudier les effets fonctionnels de l'inhibition de CD38 dans la DMD, nous avons ensuite évalué des paramètres clés de cette pathologie. Les données obtenues chez la souris mdx/CD38-/- montrent une importante amélioration du phénotype histologique et fonctionnel, avec une réduction de la fibrose musculaire accompagnée de bénéfices importants sur les performances musculaires et respiratoires ainsi qu’un rétablissement total de la fonction cardiaque. Enfin, dans un protocole de stress bêta-adrénergique, la délétion de CD38 chez la souris mdx a également permis de prévenir les dommages histologiques et l'hypertrophie cardiaque induits par l'isoprotérénol, qui simule l'apparition d'une cardiomyopathie chez les patients atteints de DMD.Notre étude montre que CD38, plus active et plus exprimée chez la souris mdx, contribue de manière importante à son phénotype dystrophique. Une réduction de son activité permet de réduire l’excès de Ca2+, de rétablir le niveau de NAD+, et d’obtenir des bénéfices fonctionnels importants chez la souris. Enfin, notre étude sur des myotubes humains issus de patients DMD montre qu’un anticorps anti-CD38 réduit l’excès de Ca2+ libéré, soulignant ainsi que notre stratégie innovante ciblant CD38 pourrait être rapidement disponible pour les patients, grâce au développement d’anticorps thérapeutiques anti-CD38 déjà sur le marché