Universidad de Zaragoza, Prensas de la Universidad
Abstract
La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) se ha convertido en una de lastécnicas de elección en el diagnóstico clínico por su rapidez, sensibilidad y especificidad. Estatécnica se ha implementado como reemplazo o apoyo a las técnicas de diagnósticoconvencionales, ya que su rapidez y fiabilidad permiten, además de identificar al agenteetiológico de la enfermedad, orientar el tratamiento del paciente, contener la infección y frenarlos contagios. Recientemente, su papel en el control de la pandemia por el Coronavirus de tipo2 causante del Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS-CoV-2) ha sido crucial para llevar acabo un buen control epidemiológico. Además, esta técnica permite cuantificar el número decopias de un gen diana en particular, lo que resulta muy valioso como indicador de la evoluciónde un paciente a un determinado tratamiento.El incremento de la disponibilidad de ensayos qPCR debe ir asociado a una mayor disponibilidadde materiales de referencia, esto es, controles del proceso que permitan validar la técnica ydetectar posibles resultados falsos positivos o negativos, los cuales podrían tener un impactodesfavorable en la salud del paciente y en el control de la enfermedad. Por otra parte, estoscontroles son necesarios para comparar la sensibilidad y especificidad entre diferentes ensayosqPCR, interpretar los resultados de los análisis inter- e intra-laboratorio o llevar a cabo estudiosde validación de ensayos qPCR cumpliendo la normativa vigente. Sin embargo, a pesar de surelevancia, la disponibilidad de controles del proceso para ensayos qPCR es limitada, ya sea porla escasa disponibilidad de muestras clínicas, en el caso de patógenos emergentes, exóticos y/oendémicos, la dificultad técnica de su cultivo o la necesidad de instalaciones de alto nivel debioseguridad para su manipulación.Un control de proceso debe cumplir idealmente los siguientes requisitos: monitorizar todas lasetapas del proceso, presentar una estructura similar a la muestra testada, ser no infeccioso,reproducible, estable en el tiempo y aplicable a una amplia gama de ensayos.Existen en el mercado diferentes tipos de controles, en su mayoría consistentes en secuenciassintéticas de DNA, plásmidos que contienen el DNA de interés o secuencias de RNA obtenidaspor transcripción in vitro. Estos controles permiten monitorizar la reacción de qPCR, pero nomonitorizan con fidelidad el paso previo de extracción de ácidos nucleicos, ya que no imitan alpatógeno que se desea identificar, carecen de estructura externa y son susceptibles a ladegradación por nucleasas; y, en el caso de las secuencias sintéticas de DNA o DNA plasmídico,tampoco se monitoriza la etapa previa de retrotranscripción. Por otra parte, se comercializancepas de diferentes bacterias, virus o parásitos que son aislados de pacientes con infección ypermiten la monitorización completa del proceso de qPCR (incluyendo la extracción de ácidosnucleicos), pero, en algunos casos, su manipulación requiere medidas y contención propia de unnivel de bioseguridad 3 o superior, por lo que se precisa de instalaciones muy concretas ypersonal experimentado.En este proyecto de investigación se propone una estrategia, basada en la transfección decélulas eucariotas con plásmidos lentivirales, para la generación in vitro de partículas viralesrecombinantes, no infecciosas y de genoma RNA, dando respuesta a las limitacionesanteriormente comentadas. Los vectores lentivirales están ampliamente extendidos en elcampo de la terapia génica, en virología o en el desarrollo de vacunas, sin embargo, su aplicaciónpara la generación de controles de proceso de los ensayos de qPCR es novedosa.Esta tecnología explota la capacidad que poseen los virus de empaquetar un ácido nucleicoexógeno, siempre que su tamaño no exceda el límite del sistema y su secuencia contenga unas mínimas señales de empaquetamiento. Se trata de un sistema muy versátil, mediante el cual esposible crear infinidad de controles, cuya estructura externa sea común a todos ellos(correspondiente a lentivirus) y el genoma empaquetado variable, en función del control deproceso diseñado.En el presente proyecto, para la generación in vitro de partículas virales recombinantes degenoma RNA ha sido necesario, en primer lugar, la confección de una colección de plásmidosque contengan fragmentos del genoma o el genoma completo de los virus de interés. Ensegundo lugar, la puesta a punto de un protocolo de generación de partículas virales y,finalmente, la purificación de las partículas virales, su cuantificación por PCR digital y suestabilización mediante liofilización. Las partículas virales desarrolladas se han validado para suuso como control positivo de ensayos de RT-qPCR, evaluando su funcionalidad tras serprocesadas por diferentes sistemas de extracción de ácidos nucleicos y diferentes ensayos dePCR en tiempo real, así como su reproducibilidad y repetibilidad. También se han realizadodiferentes ensayos orientados a determinar la vida útil del producto y su estabilidad endiferentes condiciones. Por último, se ha evaluado su capacidad infectiva y se ha verificado,mediante secuenciación masiva, la secuencia del RNA contenido en las partículas virales.Los resultados obtenidos indican que las partículas virales sintetizadas en este proyecto:¿ Son partículas virales no infecciosas y defectivas para la replicación. Todas las partículasvirales creadas mediante este sistema pueden ser manipuladas en nivel de bioseguridadtipo 2.¿ Son un control fiable del proceso de extracción de ácidos nucleicos, ya que mimetizanla estructura de un virus salvaje, por lo que se consigue una monitorización completadel proceso, desde la extracción de ácidos nucleicos hasta la amplificación por qPCR,incluyendo la etapa previa de retrotranscripción.¿ Se trata de un producto reproducible y estable en el tiempo. Se presenta en formatoliofilizado, por lo que se puede transportar y almacenar a temperatura ambiente, ypresenta una vida útil de dos años.¿ De uso universal. Son compatibles con cualquier sistema optimizado de extracción deácidos nucleicos y PCR en tiempo real y accesibles a cualquier laboratorio, sin necesidadde instalaciones y medidas de contención propias de un nivel de bioseguridad elevado.<br /
