Contribution to the understanding of resistance mechanisms to new beta-lactams observed in clinical strains of Gram-negative bacilli : inputs from molecular biology and pharmacokinetic/pharmacodynamic analysis

Abstract

L’antibiorésistance est un phénomène décrit depuis la découverte des premiers antibiotiques. Cependant, leur utilisation déraisonnée, à la fois en santé humain et vétérinaire, a favorisé l’émergence et l’installation de mécanismes de résistance à de nombreuses classes d’antibiotiques, dont les bêta-lactamines. Cette classe constitue le traitement de référence des infections à bacilles Gram-négatifs, comme Pseudomonas aeruginosa et Klebsiella pneumoniae. De nouvelles bêta-lactamines, comme l’association ceftolozane/tazobactam, ceftazidime/avibactam ou encore le cefiderocol, ont été développées pour être efficace sur les bactéries multi-résistantes. L’émergence de mécanismes de résistance spécifiques à ces molécules a malheureusement été décrite lors de leur utilisation clinique. De plus, de nombreux outils de diagnostics, comme le séquençage du génome entier, permettent d’identifier le ou les mécanismes potentiellement responsables de la résistance.Dans ce contexte, le but de cette thèse est d’utiliser des approches complémentaire de microbiologie, incluant de la biologie moléculaire, à des méthodes de modélisation de données, afin de caractériser des mutations responsables de résistance aux nouvelles bêta-lactamines. Dans une première partie, un couple de P. aeruginosa, initialement sensible au ceftolozane/tazobactam, puis devenu résistant sous traitement par cette association, a été spécifiquement étudié. Les mutations probablement responsables de la résistance ont été identifiées par séquençage génome entier (AmpC:p.G183D et AmpD:p.H157Y), puis reproduites dans une souche de référence (PAO1). Les données expérimentales ont montré une décorrélation entre les mesures de concentration minimal inhibitrice (CMI) et les résultats de courbes de bactéricidie (TKC). La modélisation semi-mécanistique pharmacocinétique/pharmacodynamique a permis de décrire de façon précise l’impact de chaque mutation, en incluant la contribution dans la résistance acquise (effet immédiat) et la résistance adaptative. Les outils utilisés lors de cette première partie ont permis l’obtention de résultats sur la sensibilité à l’imipénème et au ceftazidime/avibactam. Ces données sont importantes pour comprendre l’effet de mutations individuelles et associées sur la sensibilité aux antibiotiques, notamment dans le cadre du développement des antibiogrammes in silico.Dans une seconde partie, la résistance au cefiderocol apparue dans des souches cliniques de K. pneumoniae a été investiguée grâce à la mise en place de méthodes de séquençage de troisième génération au sein du laboratoire. La description de tous les mécanismes de résistance déjà présents a pu être réalisée, et une nouvelle mutation dans le gène fiu, jamais identifiée dans une souche clinique, a pu être mise en évidence.Antibiotic resistance has been described since the discovery of the first antibiotics. However, their inappropriate use in both human and veterinary health has led to the emergence and establishment of resistance mechanisms to many classes of antibiotics, including beta-lactams. This class is the standard of car for Gram-negative bacilli treatment, such as Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella pneumoniae. New beta-lactams, such as ceftolozane/tazobactam, ceftazidime/avibactam or cefiderocol, have been developed to be effective against multi-drug resistant bacteria. The emergence of specific resistance mechanisms to these last-resort molecules has already been described during their clinical use. Furthermore, numerous diagnostic tools, such as whole genome sequencing, allow the identification of the mechanism(s) potentially responsible for antibiotic resistance.In this context, the aim of this thesis is to use complementary microbiology approaches, like molecular biology, to data modelling methods, in order to characterize mutations responsible for resistance to new beta-lactams.In the first part, a clinical pair of P. aeruginosa, initially susceptible to ceftolozane/tazobactam, then becoming resistant under treatment with this drug, was specifically studied. Mutations probable involved in resistance were identified by whole genome sequencing (AmpC:p.G183D and AmpD:p.H157Y) and then replicated in a reference P. aeruginosa strain (PAO1). Experimental data showed a decorrelation between minimum inhibitory concentrations (MICs) measurements and time-kill curves (TKC) results. Semi-mechanistic pharmacokinetic/pharmacodynamic modelling was used to accurately describe the impact of each mutation, including the contribution to acquired resistance (immediate effect) and adaptive resistance. The tools used in this first part allowed the obtention of results on susceptibility to ceftazidime/avibactam and imipenem. These data are important to understand the effect of individual and associated mutations on antibiotic susceptibility, particularly in the context of the development of in silico susceptibility testing.In a second part, resistance to cefiderocol in clinical isolates of K. pneumoniae was investigated thanks to the implementation of third generation sequencing methods in the laboratory. The description of all resistance mechanisms already present in the isolates was carried out, and a new mutation in the fiu gene, coding a siderophore receptor, was identified for the first time in a clinical isolate