Immune microenvironment of ovarian cancer : evolution under chemo/immunotherapy and characterization of the heterogeneity and role of antibody-secreting cells

Abstract

Mon projet concerne les carcinomes ovariens séreux de haut grade (HGSOC) et avait pour objectifs i) d'étudier l'impact de la chimiothérapie (CT) +/- immunothérapie (IT) sur les cellules immunitaires adaptatives, ii) d’identifier des biomarqueurs de réponse à ces traitements, et iii) de caractériser l'hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle des cellules sécrétant des anticorps (ASC) infiltrant la tumeur et leur impact clinique. A partir d'échantillons de l'essai clinique de phase II NeoPembrOv (PI : Pr Ray-Coquard I.), qui vise à évaluer l'efficacité du Pembrolizumab en association avec la CT dans les HGSOC non résécables d’emblée, et par du RNA-seq et des marquages de tumeurs par immunofluorescence multiplexée (multi-IF), nous montrons que la chimiothérapie augmente de manière significative la densité des structures lymphoïdes tertiaires, des lymphocytes CD8 et des ASC IgA+ à la fois dans la tumeur et le stroma, et des macrophages de type 2, tandis que les lymphocytes B totaux et les ASC IgG+ restent stables. L’addition d’anti-PD-1 est associée à une augmentation significative des lymphocytes T CD8+PD1+ intra-épithéliaux. Une infiltration monocytaire exprimant de faibles niveaux de TREM2 ainsi qu’une infiltration intra-épithéliale de CD8+PD1+ sous traitement sont associées à la réponse au traitement évaluée par une absence de rechute à 24 mois. Au contraire, une forte densité en cellules endothéliales exprimant des taux élevés de PGF avant traitement était associée à une résistance à la combinaison CT+anti-PD-1. Grâce à des analyses par cytométrie de flux multiparamétrique, des marquages multi-IF associés à la pathologie digitale et du séquençage d’ARN en cellules uniques, nous montrons que les HGSOC sont infiltrés par des cellules B aux différents stades de différenciation, dont 40 % sont des ASC constitués à la fois de plasmablastes et de cellules plus matures spécialisées dans le sécrétion d’anticorps . Ces ASC se localisent dans le stroma et dans une moindre mesure dans la tumeurs, produisent majoritairement des IgG, mais une fraction des patientes est enrichie en ASC IgA+. La chimiothérapie néo-adjuvante (NACT) induit un remodelage du compartiment B avec une augmentation des lymphocytes B naïfs et des ASC et des B mémoires exprimant IgA. L'exploration des données transcriptomiques (RNA-seq) du TCGA et l'analyse multi-IF d’une cohorte de patientes a révélé qu'une densité tumorale élevée d'ASC à IgG, et dans une moindre mesure d’ASC à IgA, est associée à une meilleure survie dans les HGSOC. De plus, un ratio IgA/IgG élevé est associé à une moins bonne survie sans progression, suggérant un impact délétère des IgA. En revanche, aucun impact n’est retrouvé pour les patientes traitées par NACT. L’analyse des réactivités antigéniques des anticorps dans le sérum et les tumeurs (n = 35) à l’aide de puces à peptides chevauchant montre que les IgG et les IgA ciblent principalement des protéines différentes et que les antigènes associés à la tumeur et les cancer-testis antigènes sont plus fréquemment ciblées dans le micro-environnement tumoral par les IgG que par les IgA. Enfin, nos données préliminaires de scRNA-seq combiné au BCR-seq montrent une plus faible expansion clonale dans les tumeurs traitées versus naïves, à la fois dans les lymphocytes B mémoires et les ASC, et que les ASC à IgA présentent un phénotype immunosuppresseur avec une régulation à la hausse de gènes impliqués dans l'angiogenèse (VEGFA, VEGFB, PIGF, ANG, AGGF1).My project concerns high-grade serous ovarian carcinomas (HGSOC) and has the objectives i) to study the impact of chemotherapy (CT) +/- immunotherapy (IT) on adaptive immune cells, ii) to identify biomarkers of response to these treatments, and iii) to characterize the phenotypic and functional heterogeneity of antibody-secreting cells (ASC) infiltrating the tumor and their clinical impact. Using samples from the NeoPembrOv phase II clinical trial (PI: Pr Ray-Coquard I.), which aims to assess the efficacy of Pembrolizumab in combination with CT in unresectable HGSOC, and by analysing RNA-seq and multiplexed immunofluorescence (multi-IF) tumor staining data, we show that chemotherapy significantly increases the density of tertiary lymphoid structures, CD8 lymphocytes and IgA+ ASCs in both the tumor and the stroma, and type 2 macrophages, while total B cells and IgG+ ASCs remain stable. The addition of anti-PD-1 is associated with a significant increase in intraepithelial CD8+PD1+ T cells. Monocytic infiltration expressing low levels of TREM2 as well as intraepithelial infiltration of CD8+PD1+ under treatment are associated with response defined as an absence of relapse at 24 months. On the contrary, a high density of endothelial cells expressing high levels of PGF before treatment was associated with resistance to the CT+anti-PD-1 combination. Using multiparameter flow cytometry analyses, multi-IF labeling associated with digital pathology and single-cell RNA sequencing, we show that HGSOCs are infiltrated by B cells at different stages of differentiation, of which 40% are ASCs consisting of both plasmablasts and more mature cells specialized in antibody secretion. These ASCs are localized in the stroma and to a lesser extent in the tumors, produce mainly IgG, but a fraction of the patients is enriched in ASC IgA+. Neoadjuvant chemotherapy (NACT) induces a remodeling of the B compartment with an increase in naïve B lymphocytes and ASCs and memory B cells expressing IgA. TCGA transcriptomic (RNA-seq) data mining and multi-IF analysis of a cohort of patients revealed that a high tumor density of IgG ASC, and to a lesser extent of IgA ASC , is associated with better survival in HGSOC. In addition, a high IgA/IgG ratio is associated with poorer progression-free survival, suggesting a deleterious impact of IgA. On the other hand, no impact was found for patients treated with NACT. Analysis of antibody antigen reactivities in serum and tumors (n=35) using overlapping peptide arrays shows that IgG and IgA mainly target different proteins and that tumor-associated antigens and cancer-testis antigens are more frequently targeted in the tumor microenvironment by IgG than by IgA. Finally, our preliminary data of scRNA-seq combined with BCR-seq show a lower clonal expansion in treated versus naïve tumors, both in memory B cells and ASCs, and that IgA ASCs exhibit an immunosuppressive phenotype with upregulation of genes involved in angiogenesis (VEGFA, VEGFB, PIGF, ANG, AGGF1)