Oxygen is a crucial parameter for organotypic in vitro-cultures which
						are still performed under ambient atmosphere supplemented with 5 %
						CO2. This can lead to hyperoxia with its associated effects on signaling
						cascades and their effects on cellular behavior. Here, we describe a
						platform that enables real-time, label-free, optical oxygen (gradient)
						measurements in organotypic 3D-/organoid cultures thus allowing for
						physioxic culture and assay conditions in e. g. mito stress tests and
					substance testing

Gottwald, Eric

Grün, Christoph

Liebsch, Gregor

KITopen

758 WISSENSCHAFT ·  SPECIAL:  TISSUE ENGINEERING & ORGANOIDEBIOspektrum  |  07.23  |  29. Jahrganggungen bislang nicht quantitativ erfasst wer-den können. Zellkulturen werden zum größ-ten Teil immer noch unter Umgebungsatmo-sphäre, also bei einer Sauerstoffkonzentrati-on von 20,95 Prozent unter Zusatz von fünf Prozent CO2, kultiviert. Dies führt in der mit Feuchtigkeit gesättigten Brutschrankatmo-sphäre zu einer Sauerstoffkonzentration von etwa 18,5 Prozent [1]. Derartig hohe Sauer-stoffkonzentrationen treten aber im mensch-lichen und tierischen Körper nicht auf, wes-halb in vitro-Kulturen in der Regel tatsächlich einer Hyperoxie ausgesetzt sind, wenn von „Normoxie“ die Rede ist. Hyperoxische Bedingungen können einen deutlichen Ein-fl uss auf zelluläre Signalkaskaden haben und führen zur Bildung reaktiver Sauerstoffspe-zies (ROS). Diese rufen eine akute Toxizität durch makromolekulare Beschädigungen hervor und werden in vivo langfristig mit der Entstehung verschiedener Krankheiten wie Krebs, männliche Unfruchtbarkeit, Diabetes mellitus Typ 2, Herzinsuffi zienz und Alte-rung in Verbindung gebracht. Ebenso gewe-beuntypisch sind natürlich auch echte hypo-xische Kulturbedingungen, unter denen die Zellen einen Sauerstoffmangel erleiden. Während in Lebewesen Sauerstoff im Blut durch die Blutgefäße in die Gewebe und nur postkapillär in die Zellen diffundiert, erfolgt in der Zellkultur die Sauerstoffversorgung meist ausschließlich durch Diffusion in das Medium. In 3D-Zellkulturmodellen ist die Sauerstoffversorgung komplexer, da O2 auch noch durch die Gewebeschichten diffundie-ren muss. Dies kann zu unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen innerhalb eines Systems und auch zu Sauerstoffgradienten innerhalb der Gewebe führen, die sich damit aber der in vivo-Situation annähern. Als gewebetypische Normoxie bezeichnet man einen Sauerstoffgehalt von 10–21 Prozent, während die Hypoxie Sauerstoffkonzentra-tionen deutlich darunter (unter 5 %) und die Hyperoxie Sauerstoffkonzentrationen über 21 Prozent bezeichnet [2]. Ein weitaus ent-scheidenderer Faktor ist jedoch, dass diese in der Atmosphäre vorliegende Normoxie nicht identisch mit gewebetypischen Sauer-ERIC GOTTWALD1, CHRISTOPH GRÜN1, GREGOR LIEBSCH21 AG 3D-ZELLKULTURSYSTEME, ABT. BIOPROZESSTECHNIK UND BIOSYSTEME,   INSTITUT FÜR FUNKTIONELLE GRENZFLÄCHEN, KARLSRUHER INSTITUT FÜR   TECHNOLOGIE (KIT)2 PRESENS PRECISION SENSING GMBH, REGENSBURG Oxygen is a crucial parameter for organotypic in vitro-cultures which are still performed under ambient atmosphere supplemented with 5 % CO2. This can lead to hyperoxia with its associated effects on signaling cascades and their effects on cellular behavior. Here, we describe a platform that enables real-time, label-free, optical oxygen (gradient) measurements in organotypic 3D-/organoid cultures thus allowing for physioxic culture and assay conditions in e. g. mito stress tests and substance testing. DOI: 10.1007/s12268-023-2045-1© Die Autoren 2023ó Insbesondere für die Testung neuer akti-ver pharmazeutischer Inhaltsstoffe (API) sind gewebetypische in vitro-Systeme von größter Bedeutung. Allerdings stehen in vivo-nahe Testsysteme nur selten zur Verfügung, weshalb in den letzten Jahren immer wieder bereits zugelassene Medikamente wegen unvorhergesehener toxischer Nebenwirkun-gen vom Markt genommen werden mussten. Dies kann z. T. damit begründet werden, dass Substanzwirkungen auf die mitochondriale Atmungskette unter physiologischen Bedin-Organotypische ZellkulturO2-sensitive Mikrokavitätenarrays: 3D-Zellkultursystem mit Sensorfunktion˚ Abb. 1: Setup und Messprinzip der Sauerstoffmessung. A, Einzelkavität mit Messbereichen für O2. Sphäroide/Organoide werden in den Mikrokavitäten erzeugt und kultiviert. Durch das Messsys-tem wird die Sauerstoff-empfi ndliche Folie mit geeignetem kurzwelligem Licht (blauer Pfeil) ange-regt, woraufhin die emittierte Fluoreszenz (roter und grüner Pfeil) sowohl im Bereich des Sphäro-ids/Organoids der Mikrokavität, in dessen direkter Mikroumgebung als auch im Bereich der Fase zur Gradientenbestimmung gemessen werden kann. B, Messprinzip des dynamischen Quenchings. Das Sauerstoff-sensitive Fluorophor emittiert in Abwesenheit von O2 eine höhere Fluoreszenz als in Anwesenheit von O2, das durch strahlungslosen Energietransfer die Fluoreszenz löscht (dynami-sches Quenching). Das Referenzfl uorophor reagiert in beiden Situationen gleich, sodass durch ratiometrische Auswertung die Sauerstoff konzentration bestimmt werden kann. A BBIOspektrum  |  07.23  |  29. Jahrgang759en, die Sauerstoffmessungen in 3D-Kultur-systemen zeigen. Es wäre daher von größter Wichtigkeit, den Sauerstoff in einem 3D-Kul-tursystem in Echtzeit, markierungsfrei und ohne Sauerstoffverbrauch in der direkten Mikroumgebung des Gewebes unter physio-logischen Bedingungen messen zu können.Sauerstoff-sensitive Folien zur Messung der Sauerstoffkonzentration und von SauerstoffgradientenMit der Erforschung von lumineszierenden Farbstoffen, die bei Kontakt mit O2 mit dem dynamischen Quenching-Effekt reagieren, wurde eine neue Methode zum Nachweis von Gewebesauerstoffkonzentrationen möglich. Zu diesen gehören unter anderem Pt(II)- und Pd(II)-Porphyrinkomplexe, die sich aufgrund ihrer Quencheffekte für Sauerstoffmessun-gen im Bereich von 0–200 μM eignen [6]. Darüber hinaus können die Reporterfarbstof-fe in verschiedenen Formaten formuliert werden, indem sie in speziellen Polymeren immobilisiert werden, die die Sauerstoffdif-fusion erlauben, aber ein Ausbluten der Farb-stoffe in das Messmedium verhindern, sodass intrazelluläre (Format: Nano-/Mikro-stoffkonzentrationen ist, sodass hierfür der Begriff einer gewebetypischen Normoxie defi niert werden muss, die auch als Physi-oxie bezeichnet wird [3]. Physioxische Sauerstoffkonzentrationen sind schwer zu ermitteln und deshalb nur unzureichend bekannt. Auf dem Weg des Sauerstoffs durch einen Organismus, durch die Gewebe hin zu den Mitochondrien, sinkt der Partialdruck aufgrund verschiedener Barrieren von rund 21 Prozent O2 bis unter 1,3 Prozent in den Mitochondrien [2, 3]. Die gewebetypische Sauerstoffkonzentration, also der Bereich der Physioxie, wird daher zwischen dem Sauerstoffpartialdruck der Atmosphäre und dem in den Mitochondrien erwartet und unterscheidet sich je nach Gewebe erheblich. So wird mit den bis dato zur Verfügung stehenden Methoden die Sauer stoffkonzentration z. B. in der Leber mit 4–7,2 Prozent und im Myokard mit 2–4,9 Prozent angegeben [1, 4, 5]. Diese lie-gen weit unterhalb der 18,5 Prozent der Inkubatoratmosphäre, allerdings erreichen diese auch nicht die Zellen, da der Sauerstoff zunächst die Mediumschicht durchdringen muss. Demnach wäre eine versuchsbeglei-tende Kontrolle der Sauerstoffsättigung in der direkten Umgebung der Zellen nicht nur wünschenswert, sondern sehr sinnvoll. So auch für die Untersuchung organotypischer Reaktionen in einer Kultur, da hier u. U. die Sauerstoffhistorie der Vor- und Nachkultur von Interesse sein kann.Sauerstoffmessverfahren in vitroFür die Sauerstoffmessung stehen zwar im Prinzip mehrere Verfahren zur Verfügung, allerdings sind die wenigsten für in vitro-Anwendungen geeignet. Häufi g verwendet werden polarografi sch, punktuell messende Methoden, die allerdings Sauerstoff-verbrau-chend sind und insbesondere für die Mes-sung in sehr kleinen Volumina kritisch zu sehen sind. Alternativ kann über O2-assozi-ierte Parameter, z. B. die Expression des Hypoxie-induzierten Faktors 1α, indirekt die Sauerstoffsituation eingeschätzt werden. Ins-besondere Fluoreszenzverfahren haben sich daher in den letzten Jahren für Sauerstoff-messungen in der Zellkultur etabliert, da sie marker- und berührungsfrei, in Echtzeit und ohne O2-Verbrauch messen können (Abb. 1). Allerdings gibt es bislang nur wenige Studi-˚ Abb. 2: Herstellung und Verwendungsbeispiele der Sensorarrays. A, Herstellung der Sensorarrays durch Mikrothermoformen. Eine planare Polycarbonat(PC)-Folie wird zunächst mit Sensor- und Referenz fl uorophor beschichtet. Die Folie wird anschließend in das Formwerkzeug gelegt und mithilfe von Vakuum auf der Unterseite (Δp = Druckänderung), Druck auf der Oberseite (Δp ) und Erhitzen (ΔT = Temperaturänderung) geformt. Nach dem Erkalten (ΔT) kann der Sensorarray aus der Form entnommen werden. B, Die Sensorarrays können als Inserts in Multiwellplatten (links), Objekt-trägerformaten (Mitte) und in Organ-on-a-Chip-Plattformen (rechts) mit aktivem Fluss verwendet werden.  ABBIOspektrum  |  07.23  |  29. Jahrgang760 WISSENSCHAFT ·  SPECIAL:  TISSUE ENGINEERING & ORGANOIDEhensweise (intrazellulär vs. extrazellulär) sinnvoll das Bild der Gesamt-Sauerstoffsitu-ation in einer Kultur erfassen bzw. ergänzen. Mithilfe der Sensorarray-Plattform können nun auch z. B. Mito-Stresstests in 3D durch-geführt werden. In diesen werden die Zellen auf ihre mitochondriale Atmung hin unter-sucht, indem zunächst durch Zu gabe von Oligomycin die ATP-gekoppelte Respiration bestimmt werden kann. Durch anschließen-de Zugabe des auf die Atmungskette entkop-pelnd wirkenden Carbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP) kann die maximale Respiration und schließ-lich durch Zugabe von Rotenon und Antimy-cin A der Anteil des nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs gemessen werden (Abb. 3, [9]). Bereits verfügbare Messsyste-me, die zwar das gleiche Messprinzip nutzen, aber planare Folien einsetzen, können nur den O2-Gehalt der gesamten, bei Messdurch-führung gegenüber der Außen atmosphäre verschlossenen, Mess-/Kulturkammer Die Kavitäten bleiben auch bei der Mes-sung gegen das Medium offen, sodass Sauer-stoff nachdiffundieren kann. Die Mikrokavi-täten weisen dabei am oberen Ende eine Fase auf, die es ermöglicht, auch O2-Gradienten oberhalb einer statischen oder dynamischen Kultur zu messen. Auch dies ist bislang nicht möglich gewesen und ermöglicht neue Ein-blicke in laufende 3D-Kulturen. Die Sensor-arrays können nicht nur als System zur Erzeugung und Kultivierung der Sphäroide/Organoide selbst verwendet werden (Selbst-organisation von 3D-Aggregaten, die durch einfaches Pipettieren der Zellen in formge-naue Mikrokavitäten sehr ähnliche Größen und Formen aufweisen), sondern liefern dar-über hinaus Sauerstoffdaten aus der direkten Mikroumgebung der Aggregate. Dies unter-scheidet unseren Ansatz zwar fundamental von solchen, in denen intrazellulär Sauerstoff über von den Zellen aufgenommene Mikro-partikel gemessen werden, das System kann aber durch die unterschiedliche Herange-partikel) und extrazelluläre (Format: planare Folien) Messungen durchgeführt werden können. Da jedoch Mikropartikel den Ener-giemetabolismus der Zellen ändern können und 3D-Aggregate/Organoide auf fl ächigen Sensorfolien unkontrollierte O2-Nachdiffusi-on erfahren, sind diese Sensorformate nicht für Messungen in der direkten Mikroumge-bung von 3D-/Organoidkulturen einsetzbar. Unser Ansatz erweitert nun die Sauerstoff-messung auf 3D-/Orga noid kulturen aller Art, indem eine mit Sensorfarbstoff beschichtete, planare Polycarbonatfolie einem Mikrother-moformverfahren unterzogen wird [7, 8]. Die so entstehenden Mikrokavitätenarrays mit Sensorfunktion, die Sensorarrays, sind durch ihr Design in der Lage, nicht nur permanent die Sauerstoffkonzentration in der Mikroum-gebung der 3D-Kultur/Organoide zu messen, sondern durch die integrierte Fase an der Oberseite der Mikrokavitäten auch Sauer-stoffgradienten bzw. die Nachdiffusion aus dem Medium (Abb. 1). ˚ Abb. 3: Workfl ow für das O2-Fingerprinting: 1: Multiwellplatten-Insert mit vier Mikrokavitätenfeldern für parallele Messungen. 2: simultane O2-Datenaufnahme der Fase (links, rot) zur O2-Gradientenbestimmung und der Mikroumgebung des Sphäroids/Organoids aus der Kavität (rot, Mitte) und möglicher weiterer (Fluoreszenz-)mikroskopischer Parameter (rechts). 3: Durch die Multiplexingmöglichkeit bei der Datenaufnahme können in einer 12-Well-Platte z. B. bis zu 1.440 Mito-Stresstests parallel aufgenommen werden. 4: Durch Sauerstoffverbrauchsmessungen unter physioxischen Bedingungen kann eine O2-Fingerprinting-Datenbank aufgebaut werden, die optimale Sauerstoffkulturbedingungen für jeden Zell-/Gewebetyp zur Ver-fügung stellt. BIOspektrum  |  07.23  |  29. Jahrgang761Funding note: Open Access funding enabled and organized by Projekt DEAL.Open Access: Dieser Artikel wird unter der Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz veröffentlicht, welche die Nutzung, Vervielfältigung, Bearbeitung, Verbreitung und Wiedergabe in jeglichem Medium und Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle ordnungsgemäß nennen, einen Link zur Creative Commons Lizenz beifügen und angeben, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die in diesem Artikel enthaltenen Bilder und sonstiges Drittmaterial unterliegen ebenfalls der genannten Creative Commons Lizenz, sofern sich aus der Abbildungslegende nichts anderes ergibt. Sofern das betreffende Material nicht unter der genannten Creative Commons Lizenz steht und die betreffende Handlung nicht nach gesetzlichen Vorschriften erlaubt ist, ist für die oben aufgeführten Weiterverwendungen des Materials die Einwilligung des jeweiligen Rechteinhabers einzuholen. Weitere Details zur Lizenz entnehmen Sie bitte der Lizenzinformation auf http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.de.Korrespondenzadresse: Prof. Dr. Eric GottwaldAG 3D-ZellkultursystemeAbt. Bioprozesstechnik und BiosystemeInstitut für Funktionelle Grenzfl ächenKarlsruher Institut für TechnologieHermann-von Helmholtz-Platz 1D-76344 Eggenstein-Leopoldshafeneric.gottwald@kit.educhondrial morphology while reducing DNA damage. FASEB J 33: 5716–5728[3] Carreau A, El Hafny-Rahbi B, Matejuk A et al. (2011) Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med 15: 1239–1253[4] Leary TS, Klinck JR, Hayman G et al. (2002) Measurement of liver tissue oxygenation after orthotopic liver transplantation using a multiparameter sensor. A pilot study. Anaesthesia 57: 1128–1133[5] Rivera BK, Naidu SK, Subramanian K et al. (2014) Real-time, in vivo determination of dynamic changes in lung and heart tissue oxygenation using EPR oximetry. Adv Exp Med Biol 812: 81–86[6] Dmitriev RI, Papkovsky DB (2012) Optical probes and techniques for O2 measurement in live cells and tissue. Cell Mol Life Sci 69: 2025–2039[7] Giselbrecht S, Gietzelt T, Gottwald E et al. (2006) 3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre- processed polymer fi lms. Biomed Microdevices 8: 191–199[8] Gottwald E, Giselbrecht S, Augspurger C et al. (2007) A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab Chip 7: 777–785[9] Grün C, Pfeifer J, Liebsch G et al. (2023) O2-sensitive microcavity arrays: A new platform for oxygen measurements in 3D cell cultures. Front Bioeng Biotechnol 11: 1111316bestimmen. Dadurch erzeugt die Messung selbst eine zweitweise Hypoxie. Im Unter-schied zu bisherigen Systemen können die Assays mit Sensorarrays nun aber unter phy-siologischen Sauerstoffkonzentrationen stattfi nden, zusätzlich über beliebig lange Zeiträume gemessen werden und das sowohl in statischen als auch aktiv durchströmten Systemen. Die sehr in vivo-nahe Kultivierung erlaubt somit technologisch einfache, aber hinsichtlich Wirkstoffanalyse auch komplexe Assays, die wiederum den Weg hin zu zell-, gewebe- oder gar organotypischem O2-Finger-printing ebnen. AusblickMithilfe der von uns entwickelten Technolo-gie ist es nun möglich, neben 3D-Mito-Stress-tests und anderen Assays zur Charakterisie-rung der mitochondrialen Atmung, auch Substanztestungen (prinzipiell im High-Throughput) unter physiologischen Bedin-gungen durchzuführen. 3D-Mito-Stresstests wurden von uns jüngst demonstriert [9]. Mit solchen Techniken wird es nun möglich sein, die Sauerstoffkonzentration für einzelne Zell-typen unter physiologisch relevanten Kon-zentrationen und/oder bester physiomimeti-scher Funktion zu bestimmen. Dies könnte z. B. durch die Bestimmung der Expression typischer Gewebemarker auf genetischer wie auch auf Proteinebene und/oder enzymati-scher Funktionen erreicht werden. Auf diese Weise wird eine Datenbank entstehen, in der optimale in vitro-Sauerstoffkonzentrationen gesammelt werden, was zu einem Sauerstoff-Fingerprint für jeden einzelnen Zell- bzw. Gewebetyp führt (Abb. 3).   óLiteratur[1] Keeley TP, Mann GE (2019) Defi ning Physiological Normoxia for Improved Translation of Cell Physiology to Animal Models and Humans. Physiol Rev 99: 161–234 [2] Timpano S, Guild BD, Specker EJ et al. (2019) Physioxic human cell culture improves viability, metabolism, and mito-AUTORENEric Gottwald1985–1995 Biologiestudium mit Promotion im Bereich Biochemische Pharmakologie, Universität Köln. 1996–1999 PostDoc am Institut für Pharmakologie des Karlsruher Instituts für Technologie. 2000 AG-Leiter 3D-Zellkulturen. 2012 Habilitation im Be-reich Technische Biologie. Seit 2014 außerplanmäßiger Professor für Technische Bio-logie am Institut für Funktionelle Grenzfl ächen des KIT.Christoph Grün2012–2017 Studium Chemische Biologie. 2017–2019 Wiss. Mitarbeiter in einem Ausgründungsprojekt des KIT. 2019–2020 Patent- und Innovationsschutz-Manager, Fernstudium Universität des Saarlandes, Saarbrücken und Universität Koblenz-Landau. 2020–2023 Promotion zum Thema Sauerstoff-sensitive Mikrokavitätenarrays und seit 7/2023 PostDoc in der AG von Prof. Dr. Gottwald.Gregor Liebsch1991–1997 Chemiestudium, Regensburg. 2000 Promotion in Analytischer Chemie anschließend PostDoc. 2002–2010 Entwicklungsleitung Biocam GmbH. Seit 2010 Head of R&D Imaging Solutions, PreSens GmbH: Fluoreszenz-optische Sensorik und Bildgebung für die LifeSciences/Biotech für Monitoring des Energiemetabolismus an der Schnittstelle Forschung, Entwicklung und Vertrieb von Innovationen.

O2-sensitive Mikrokavitätenarrays: 3D-Zellkultursystem mit Sensorfunktion

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O2-sensitive Mikrokavitätenarrays: 3D-Zellkultursystem mit Sensorfunktion

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