En los estudios clínicos de drogas hipolipemiantes y en otros, se describe1,2 que los incrementos de colesterol total y el asociado a las LDL-C constituyen factores de riesgo principales para padecer de atereosclerosis y enfermedades asociadas a ellas, tales como infarto cardíaco, accidentes vasculares encefálicos, etc

Luis  González Bravo

Miriam Odette  Cora Medina

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COMUNICACION CORTADetermination microanalitica de colesterol totalen tejidosMiriam Odette Cora Medina y Luis Gonzalez Bravo .Centro de Productos Naturales, Cane 198 s/n entre l9 y 21, Siboney, Playa, Ciudad de La Habana, Cuba .Recibido : 28 de septiembre de 1999 .	Aceptado : lro de octubre de 1999 .Palabras lave: colesterol total, determination, micrometodo, ultrasonido .Key words: total cholesterol, determination, micromethode, ultrasonic .En los estudios clinicos de dro-gas hipolipemiantes y en otros, sedescribe' 2 que los incrementos decolesterol total y el asociado a lasLDL-C constituyen factores de ries-go principales para padecer deatereosclerosis y enfermedades aso-ciadas a ellas, tales como infarto car-diaco,accidentes vascularesencefa-licos, etc.El colesterol (C~,H~O) tiene im-portantes funciones en el organismo,como lade former parte de la estruc-tura de las membranes celulares ysubcelulares, y principalmente, ladeservir como sustrato para la sintesisde las hormones sexuales y adrena-les, la vitamins D y los acidos bilia-res? La determination del colesteroltotal en fluidos biolbgicos y en teji-dos empleando diferentes metodos"$results de gran interes en los estu-dios de la farmacocinetica y el meta-bolismo del policosanol, nueva dro-ga que reduce las concentrationssericas de colesterol y que presentsun efecto antiagregante plaqueta-rio . 7 . 9 Existen diferentes procedi-mientos para la determination delcolesterol total en fluidos biologicos,los cuales incluyen metodos y tecni-cas analiticas . Entre los primeros seencuentran aquellos que se realizanpor vies quimica (hidrolisis basics)o enzimatica9 y entre las segundas,se tiene la cromatografia gaseosaacoplada a la espectrometria de ma-sas 10 y la electroforesis ;' las cualespresentan la desventaja de ser muycostosas, a diferencia del microme-todo que results precise, de bajo cos-toy de facil manipulacion .' 2 Este me-Y 19todo se recomienda por el pequenovolumen de muestra requerido y elbajo consume de reactivos .E1 presence trabajo se propusodesarrollar una variance microana-litica para la posible determinaciOncuantitativa del colesterol total entejido hepatico, basada en una reac-ci6n de saponificacibn, seguida deuna extraccion con n-hexano y suposterior determinaciOn, empleandoultravioleta visible a 620 nm . Se rea-lizaron varies modiflcaciones meto-dologicas al metodo microanaliticopropuesto para la determination delcolesterol total en plasma con tocual, se logro adapter dicho metodoal caso de muestras de tejido hepa-tica .Rieron empleados reactivos degrade analitico : hidrbxido de potasioy n-hexano (Fluke, Suiza) ; metanolabsolute y anhidrido acetico (Merck,Alemania) ; acido acetico glacial(BDH, Analar, Inglaterra) ; colesterol(Sigma, USA) y acido sulftirico con-centrado . Se prepare una disoluciondel reactivo desarrollador de colorLiebermann-Burchard mezclando20 volUmenes de anhidrido aceticofrio, un volumen de acido sulfuricoconcentrado y 10 volumenes de aci-do acetico glacial. Esta disolucionfue utilizada dentro de la hors pos-terior a su preparaciOn . 13Se tomaronalicuotas correspondientes a 0,1 mLde homogenate de higado, se intro-dujeron en tubes de ensayo y se ana-dieron 0,05 mL de hidrbxido depotasio 33 % y 1 mL de metanol ab-solute. Las muestras fueron agitadasen un equipo vortex por espacio deRevista CENIC Ciencias Quimicas, Vol . 31, No . 1, 2000 .10 s . La hidrblisis en medio basicofue realizada en baflo Maria a 80 °Cdurance 1 h . La extraccion de la faseorganica se realiz6 anadiendo 1,5 mLde n-hexano y 0,5 mL de ague desti-lada, agitando en cads caso por es-pacio de 10 s . Las muestras fueroncentrifugadas a 3 500 r/min y se de-jaron reposar haste separation de lasfuses . Se tomaron alicuotas de 1 mLde la fase organica y se concentra-ron a sequedad en un vial a 100 °C .Se anadieron alicuotas de 3 mL delreactivo Liebermann-Burchard . Elcolor se desarrollo completamente30 min despues y la absorbancia sedetermin6 a 620 nm a muestras ypatrons medidos con referencia aun blanco que fue el mismo reacti-vo de color, en un espectrofot6metroUV Visible . Las modifications delmicrometodo consideraron las con-ditions siguientes : 80 °C, empleode sistema cerrado, ultrasonido ytiempo de extraccion de la fase or-ganica en 2, 4, 6 y 7 h . Se desarrolla-ron seis ensayos (Table 1) .Las disoluciones patrons fueronpreparadas disolviendo 1,5 ; 2 ; 2,5 ; 3 ;3,5 y 4 mg de colesterol en 25 mLde n-hexano (matraces aforados de25 mL), Cro1 = 0,06; 0,08 ; 0,10 ; 0,12 y0,14 (mg/mL) .Se tomaron alicuotas de 1 mLde estas disoluciones patrons y setrasvasaron a tubes de ensayo . Seanadieron 0,05 mL de una disolu-cion de hidrbxido de potasio 33 %y 0,1 mL de ague destilada . Lospatrons fueron sometidos al mis-mo procedimiento que las mues-tras .Revista CENIC Ciencias Quimicas, Vol . 31, No . 1, 2000 .Table 1. Condiciones de trabajo en cads uno de los ensayos desarrollados, para1 h de saponi•icacion .Table 2. Concentracidn promedio decolesterol total (Cr°1 ), determinada porel micrometodo conventional (EnsayoA) y por el modifrcedo (Ensayos B-G) .n=4 .E 4o aFK zaWzTIEMPO (M1)Fig- 1 . Curua de equilibrio correspondiente a la extracciOn del colesterol total en teji-do hepdtico en el tiempo .El analisis estadistico fue reali-zado para determiner Si existian di-ferencias significativas entre los en-sayos (Prueba de Lord) . La formulautilizada fue la siguiente :xa - xau-- RR + Rbdonde :x 5 y x, Valores promedio de coleste-rol total .CURVA DE EOUILIBRIOTable 3 . Valores experimentales de laprueba de Lord (U), al comparar losexperimentos entre Si .R° y Re Magnitud mayor y menorde cede ensayo .Pare n a = n h .n Nl mero de replicas .Mediante el micrometodo con-ventional no se logra extraer cuan-titativamente el colesterol total deltejido hep`atico (Table 2, ensayo A),por to cual se realizaron algunas mo-dificaciones con vistas a mejorar laextraction, motivo por el cual se tra-bajo a 80°C con sistema cerrado paraevitar la evaporation del metanolabsoluto (Table 2, ensayo B) . No seobservaron diferencias significati-vas con los cambios anteriormentemencionados (Table 3), por to que seincorporo el empleo del ultrasonidopara lograr una extraction cuanti-tativa del colesterol total (EnsayoC), to cual condujo a incrementarlo(Table 3). Esto se debe a que ocu-rre una interaction mucho mejorde los reaccionantes en la saponi-ficacion a nivel molecular que dalugar a una mejor homogenizationdel tejido .A continuation, se promedio abuster el mejor tiempo de extractionusando baio ultrasonido (Table 1) .Se observo un incremento de laconcentration del colesterol total C~ °1con el tiempo de extraction . El tiem-po apropiado fue de 6 a 7 h . Se obser-vo que entre las experiencias F y Gno existian diferencias significativas,indicador de que el tiempo de extrac-tion seleccionado es realmente el re-querido para alcanzar el reparto delsoluto entre ambas fases (Fig . 1) .Se comprobo que el empleo delultrasonido en la extraction del co-lesterol total, mejora de una formasignificativa el rendimiento de coles-terol que se extrae del tejido en com-paracion con el micrometodo con-ventional. No obstante, las mejorasse hacen significativas tambien,cuando se aumenta el tiempo de ex-traction de la muestra, resultandooptimo entre las 6 y 7 h de tratamien-to. Se corroboro la importancia delcontrol estricto de las Condiciones ex-perimentales para evitar errores en ladetermination del colesterol total .BIB LIOGRAFIA1 . Shepherd J., Cobbe SM ., ChristopherG., Lorimer AR., Mcfarlane PV,McKillap J.H. and Packard C . Preven-tion of coronary heart disease withpravastatin in men with hypercholester-olemia. NewEngL J. Med, 333, 1300,1995 .2 . Sacks FM ., Pfeffer M .A. and Moye L .A .The effects of pravastatin on coronaryevents after myocardial infarction inpatients with average cholesterol lev-els. New Engl J . Med, 35, 1001, 1996 .3. Ross R. y Fuster V The Pathogenesisof Atherosclerosis, Chapter 25,Lippincott-Raven Publishers, Phila-delphia, 25-26, 1996 .4. Aufenanger J ., Haux P, Weber V andKattermann R . A specific method fordirect determination of lipoproteincholesterol in electroforetic patterns .Clinics Chimica Acta, 177, 197, 1988 .5. Christie William W Gas Chromatogra-phy and Lipids, A Practical Guide,Chapter 10, Ayr, Scotland, 269-270,1989 .20Ensayo Condiciones de reaction7bmperatura(t)Sistema 75empode extractionUltrasonido(30 min)A 37 abierto 10 s noB 80 cerrado 10 s noC 80 cerrado lo s siD 80 cerrado 2hE 80 cerrado 4hF 80 cerrado 6 h stG 80 cerrado 7hEnsayosEnsayo C pit DE(mg/g) A y B 0.2887A 1,430 5 m 0,17 B y C 1,8788*B 1,627 0 ._ 0,10 C y D 0,6717'C 3,151 1 ± 0,26 D y E 3,9680*D 3,560 2 z 0,11 E y F 0,7729*E 4,1101 _ 0,06 FyG 0,3122F 4,665 0 ± 0,24 n = 4, Ufae = 0,406 .G 4,914 5 ± 0,13 * Diferencias significativas .

Determinación microanálitica de colesterol total en tejidos

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