Muitos agentes patogénicos podem ser transmitidos aos humanos pelo
contacto/consumo de água contaminada representando um risco para a saúde pública. A
contaminação microbiológica deve-se maioritariamente à descarga de águas residuais
(AR) onde esses agentes, incluindo vírus, podem permanecer por longos períodos. Os
processos convencionais usados nas estações de tratamento de água residual (ETARs)
não conseguem remover/inativar na totalidade os microrganismos, incluindo alguns
patogénicos, podendo contribuir para a sua disseminação no ambiente. A qualidade da
água é avaliada através de bactérias indicadoras de contaminação fecal, no entanto, tem
sido proposto o uso de indicadores virais, devido à sua ampla distribuição, alta
estabilidade nas matrizes de água, e ausência de sazonalidade na sua circulação. Entre
várias possibilidades, os adenovírus humanos (HAdV) destacam-se pela sua alta
resistência aos processos de desinfeção aplicados nas ETARs e elevada prevalência no
ambiente. Estes vírus dividem-se em sete espécies (de A a G) e são responsáveis por
patologias graves, principalmente em populações vulneráveis (crianças, idosos e
indivíduos imunocomprometidos).
Este trabalho envolveu a avaliação da diversidade genómica de HAdV em águas da
área Metropolitana de Lisboa (AML). Para tal, foram recolhidas amostras de influentes
de ETARs e águas ambientais entre 2018 e 2021. Após concentração das partículas virais
por floculação orgânica e extração do DNA viral, foram desenvolvidos protocolos de
touch-down PCR para a amplificação de parte da região codificante de uma proteína da
cápside (hexão). Os produtos de amplificação obtidos foram analisados por um processo
de clonagem molecular em que, após seleção aleatória de alguns dos clones, se procedeu
à sequenciação das moléculas de DNA plasmídico recombinante pelo método de Sanger.
Adicionalmente, esses produtos foram sequenciados pelo método de Illumina, numa
abordagem de Sequenciação de Nova Geração (NGS). As sequências obtidas foram
analisadas combinando a pesquisa de sequências homólogas disponíveis em bases de
dados e análise filogenética, permitindo associar as sequências a uma espécie/tipo de
HAdV, e a identificar quais os circulantes na AML.
A sequenciação de Sanger revelou a presença de genomas virais da espécie HAdV F (37 %) e possivelmente de AdV de murinos (63 %) nas amostras ambientais, enquanto
as espécies HAdV-A (6 %), -C (18 %), -D (18 %) e -F (58 %) foram detetadas nas
amostras de influentes das ETARs. Como esperado, a análise das sequências obtidas por
NGS permitiu a identificação de uma maior diversidade de tipos virais pertencentes às
espécies HAdV-A (19 %), -B (1 %), -C (3 %), -D (24 %), -F (25 %), e possivelmente de
AdV de murinos (30 %) nas amostras de influente das ETARS. Nas amostras ambientais,
foram detetadas as espécies HAdV-A (19 %), -D (32 %), -F (36 %) e provavelmente de
AdV de murinos (14 %).
Assim, estes resultados indicam a presença de diferentes tipos de HAdV ao nível
das AR e em águas ambientais, demonstrando a ineficiência dos tratamentos aplicados
nas ETARs em remover partículas virais, e a presença de contaminação fecal nas águas
ambientais. Adicionalmente, a avaliação efetuada da diversidade deste vírus (através do
estudo dos seus genomas) fornece informações importantes sobre os padrões da sua
distribuição epidemiológica molecular na população.Many pathogens can be transmitted to humans through contact/consumption of
contaminated water, representing a risk to public health. The microbiological
contamination is mainly due to the discharge of untreated wastewater, where these agents,
including viruses, can remain for long periods. The conventional processes used in
wastewater treatment plants (WWTPs) cannot remove/inactivate the totality of
microorganisms including some pathogenic, which may contribute to their dissemination
in the environment. Water quality is evaluated by faecal indicator bacteria; however, the
use of viral indicators has been proposed, due to their wide distribution, high stability in
water matrices, and lack of seasonality in their circulation. Among several possibilities,
human adenoviruses (HAdV) stand out for their high resistance to the disinfection
processes applied in WWTPs, and for their high prevalence in the environment. These
viruses are divided into seven species (from A to G), and are responsible for serious
pathologies, mainly in vulnerable populations (children, elderly, and
immunocompromised individuals).
This work involved the evaluation of HAdV genomic diversity in waters of the
Lisbon Metropolitan Area (LMA). For this, WWTP influents and environmental samples
were collected between 2018 and 2021. After the concentration of viral particles by
organic flocculation and extraction of viral DNA, touch-down PCR protocols were
developed for the amplification of part of the coding region of one of the viral capsid
proteins (hexon). The amplification products obtained were analysed by a molecular
cloning process in which, after random selection of some clones, recombinant vector
(plasmid) DNA molecules were sequenced using the Sanger method. Additionally, these
products were sequenced by the Illumina method, a Next Generation Sequencing (NGS)
approach. The sequences obtained were evaluated by combining the search for
homologous sequences available in the public genomic databases, and a phylogenetic
analysis, allowing us to associate them to a HAdV species and to identify which ones are
circulating in the LMA.
The Sanger sequencing-based approach revealed the presence of viral genomes
from the HAdV-F species (37 %) and possible from murine AdV (63 %) in the
environmental samples, while species HAdV-A (6 %), -C (18 %), -D (18 %) and -F (58
%) were identified in the WWTPs influent samples. As expected, the analysis of the
sequences obtained by NGS allowed the identification of a higher diversity of viral
genomes belonging to the species HAdV-A (19 %), -B (1 %), -C (3 %), -D (24 %) and -
F (25 %), and possibly murine AdV (30 %) in the WWTPs samples. For the
environmental samples,species HAdV-A (19 %), -D (32 %) and -F (36 %) were identified
along with possible murine AdV (14 %).
The presence of different HAdV types in the water samples studied demonstrates
that the treatments applied in the WWTPs are not efficient in removing viral particles,
and the presence of faecal contamination in the environmental waters. Furthermore, the
assessment of the diversity of this virus (through the study of its genome) provides
important information about the patterns of its molecular epidemiological distribution in
the population
