Tesis (Doctor en Ciencia Químicas) – Universidad Nacional de Córdoba, 2014.Fil: Bistué Millón, María Beatriz. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.Los Desórdenes Congénitos de Glicosilación (CDG) son enfermedades genéticas
humanas, causadas por defectos en la síntesis o remodelación de N-, 0-glicoproteínas e
incluso en la biosíntesis de glicolípidos. Las manifestaciones clínicas son muy variadas,
generalmente se presentan con fenotipos multisistémicos graves, con compromiso
neurológico que va desde retraso psicomotor grave a moderada discapacidad intelectual.
Los eventos trombo-hemorrágicos son muy frecuentes siendo en gran medida causados
por alteraciones de agregación plaquetaria. Principalmente, las plaquetas forman
trombos hemostáticos para evitar la pérdida de sangre y mantener la integridad vascular.
La activación plaquetaria es un proceso dinámico, que requiere una estricta regulación
de Ca2 , para prevenir la formación de trombos inadecuada o excesiva. En muchas
células, incluyendo plaquetas, la homeostasis del Ca 2-'_ está regulada por diferentes
mecanismos, en donde los intercambiadores Na-'_/Ca 2+ (familias de las proteínas NCX)
poseen un rol fundamental. Existen dos familias de proteínas de intercambiadores
2+ + Na-'_/Ca : uno dependiente de K (NCKX) y otro independiente de K+ (NCX). Ambos
actúan como contratransportadores ya que transportan Ca 2+ en intercambio por Na,
donde la dirección del flujo está determinada por los gradientes electroquímicos de los
iones Na y Ca 2+ Recientemente, ha sido descrito que las plaquetas humanas expresan
los intercambiadores K+-independiente (NCXI y NCX3) y K -dependientes (NCKXI),
sin embargo no se conoce el estado de glicosilación presente en estas proteínas
plaquetarias.
Durante el transcurso de esta tesis, se implementó un protocolo de estudio el cual permitió identificar 8 pacientes con perfiles alterados de N-glicosilación proteica. Se
diagnosticaron 2 pacientes PMM2-CDG, portadores de mutaciones heterocigotas
compuestas en el gen PMM2. Ambos poseen la mutación con cambio de sentido más
frecuente, p.R141H (c.488G>A), en el exón 5. El paciente Pl también presentó la otra
mutación con cambio de sentido, en el exón 5 (p.E139K; c.481G>A), mientras que en
el paciente P2, la otra mutación con cambio de sentido, se encontró en el exón 8
(p.V231M; c.756G>A). A su vez, hemos identificado 4 pacientes con perfiles
anormales de glicosilación CDG Tipo-II (P5, P6, P7 y P8). En PS y P6 el análisis de
glicanos por espectroscopia de masa sugirió un defecto en los genes que codifican para
las subunidades del Complejo Oligomérico de Golgi (genes COG). Mediante análisis molecular se observó en P6 la presencia de una mutación con cambio de sentido en un
sólo alelo, en el exón 19 del gen COG6 (p.V631M; c.1891G>A). Los estudios en los
pacientes P7 y P8 se encuentran en progreso mediante el análisis por secuenciamiento
exómico con grupos colaboradores. La aplicación de tecnologías de secuenciación de
última generación, como secuenciación exómica global, permitió identificar nuevas
mutaciones en genes implicados en las vías de glicosilación. Mediante secuenciación
exómica global, se identificó al gen de la manosidasa 1 de Retículo Endoiplásmico
(MANJB1) como un nuevo gen candidato de CDG. En una cohorte de 35 pacientes sin
diagnóstico nosológico CDG-I1 (CDG-Ilx) provenientes de distintos centros de
investigación para CDG, se detectaron mutaciones en el gen MANJBJ en siete casos.
Mediante estudios funcionales de plaquetas se observó en el paciente PMM2-CDG
(P2), ausencia de agregación plaquetaria secundaria y liberación de gránulos
intracitoplasmáticos inducido por agonistas. En relación a estos hallazgos, se postuló
que existiría una alteración en proteínas plaquetarias con glicosilación anormal en
+ 2+ pacientes CDG y postulamos la participación del intercambiador Na ¡Ca de
plaquetas humanas del cuál poco se conocía respecto a su expresión y estado de
glicosilación en estas células. De esta manera, se analizó la expresión y función de los
intercambiadores NCXI y NCKX1 en megacariocitos y plaquetas humanas y se
demostró que ambos intercambiadores tanto K-independiente (NCX) como
independiente (NCKX) son funcionales en plaquetas humanas. Además, por primera
vez, se reportaron datos experimentales los cuales demostraron que ambas proteínas
están glicosiladas, siendo NCXI una N-glicoproteína y NCKX1 una 0-glicoproteína
principalmente con 0-glicanos tipo mucina. Por último, observamos que tanto la
expresión de la proteína NCXI así como la captación de Ca 2+ Na-dependiente, se
encuentran disminuidas en las plaquetas del paciente PMM2-CDG (P2) con
agregación plaquetaria anormal. Este trabajo de tesis sugiere un posible rol de la
hipoglicosilación multisistémica observada en pacientes CDG, sobre la expresión
proteica y consecuentemente en la actividad de intercambio Na17Ca 2 en plaquetas de
pacientes CDG con alteración en la agregación plaquetaria. Sin embargo otros estudios
serían necesarios para evaluar si la hipoglicosilación de estos intercambiadores tiene
un efecto directo en el mecanismo que genera alteración en la agregación plaquetaria
en pacientes con Desórdenes Congénitos de Glicosilación.Fil: Bistué Millón, María Beatriz. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina
