En el presente estudio se evaluó la susceptibilidad in vitro al benznidazol y al nifurtimox, de las formas epimastigotas de 20 cepas de T. cruzi, aisladas de diferentes hospederos en Paraguay, a fin de conocer si existen diferencias o no en cuanto a la susceptibilidad a estas drogas e identificar quizás a aquellas con resistencia natural, aspecto considerado de relevancia para la epidemiologia de la enfermedad de Chagas.CONACYT – Consejo Nacional de Ciencia y TecnologíaPROCIENCI

Acosta, Nidia

Bobadilla, Christopher

Escobar, Patricia Maria

Fernández, Ivana

López, Elsa De las Nieve

Ramírez, Analía

Sanabria, Luis Maria

YALUFF MIRANDA, GLORIA

Spanish

Yaluff Miranda, Gloria

López, Elsa de las Nieve

Sanabria, Luis María

Escobar, Patricia María

Repositorio Institucional CONACYT

SUSCEPTIBILIDAD IN VITRO DE AISLADOS DE Trypanosoma cruzi CIRCULANTES EN PARAGUAY A DROGAS UTILIZADAS EN EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGASAcosta Nidia1; Yaluff Gloria1; López Elsa1; Sanabria Luis1;Bobadilla Christopher1; Ramírez Analía1; Fernández Ivana1; Escobar Patricia2.1.Departamento de Medicina Tropical, Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de Asunción, Paraguay; 2. Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales, CINTROP, Universidad Industrial de Santander, Colombia.• Evaluar la susceptibilidad in vitro al benznidazol y al nifurtimox de aislados de Trypanosoma cruzi que circulan en el Paraguay.INTRODUCCIÓN OBJETIVOMATERIALES Y MÉTODOSEl Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, muestra una sustancialheterogeneidad fenotípica y genotípica, que podría tener cierto grado de influencia en lasvariaciones epidemiológicas y clínicas observadas en esta enfermedad, así como en lasensibilidad a los fármacos utilizados en el tratamiento. Esta enfermedad constituye unimportante problema de salud pública para los países afectados (1).Actualmente dos medicamentos están disponibles y aprobados, nifurtimox y benznidazol.Sin embargo por ensayos in vitro e in vivo se ha reportado la existencia de cepas de T.cruzi naturalmente resistentes a estos fármacos, que podrían derivar en falla terapéutica(2, 3, 4). Así mismo, se ha observado que la resistencia puede ser inducida por diferentespresiones de la droga sobre el parásito, aspecto a tener en cuenta en el tratamiento de laspersonas infectadas, ya que la administración de dosis inadecuadas y discontinuas puedefavorecer la aparición de cepas resistentes..En el presente estudio se evaluó la susceptibilidad in vitro al benznidazol y al nifurtimox, delas formas epimastigotas de 20 cepas de T. cruzi, aisladas de diferentes hospederos enParaguay, a fin de conocer si existen diferencias o no en cuanto a la susceptibilidad a estasdrogas e identificar quizás a aquellas con resistencia natural, aspecto considerado derelevancia para la epidemiologia de la enfermedad de Chagas.Financiación:  “Este Proyecto es financiado por el CONACYT través del Programa PROCIENCIA con recursos del Fondo para la Excelencia de la Educación e Investigación – FEEI del FONACIDE”. Contrato Nº 020/2015-14-inv-150.RESULTADOSTabla 1.  Características de las cepas estudiadas.BENZNIDAZOL NIFURTIMOXIC50(ug/mL)IC90 (ug/mL)IC50(ug/mL)IC90(ug/mL)CEPA UTD HOSPEDERO ORIGEN MEDIA ±DESVIO ESTÁNDAR MEDIA ±DESVIO ESTÁNDAR GRUPO MEDIA ±DESVIO ESTÁNDAR MEDIA ±DESVIO ESTÁNDAR GRUPO RF cl1 TcII HUM COR 6,93 ± 2,76 37,90 ± 0,91 A 2,27 ± 0,38 5,93 ± 0,07 AT530 CL1 TcV T. i. CHA 3,58 ± O,23 34,56 ± 1,73 A 1,88 ± 0,07 5,59 ± 0,02 AT532 CL4 TcV T. i. CHA 2,01 ± 0,23 33,45 ± 2,30 A 2,11 ± 0,06 5,72 ± 0,04 AMA 26 CL1 TcIII D. n. CHA 4,25 ± 1,56 35,04 ± 1,10 A 2,77 ± 0,19 6,49 ± 0,17 AMA 111 CL1 TcIII E. s. CHA 3,27 ± 1,32 34,13 ± 0,82 A 2,09 ± 0,10 5,77 ± 0,05 ACON 11 cl1 TcII T. i CON 2,17 ± 0,70 35,82 ± 0,45 A 1,23 ± 0,03 5,66 ± 0,12 AARMADILLO 20 cl2 TcIII D. n. CHA 3,54 ± 2,59 35,43 ± 0,62 A 1,98 ± 0.01 5,77 ± 0.03 AT601 cl1 TcV T. i. CHA 5,35 ± 2,56 37,44 ± 0,32 A 2,35 ± 0.02 5,81 ± 0.04 AAR cl1 TcII HUM CEN 4,89 ± 7,06 43,98 ± 2,78 A 1,29  ± 0,56 7,84 ± 0,21 BLENGUA15 cl1 TcVI T. i. CHA 3,56 ± 3,81 35,86 ± 1,13 A 1,10 ± 0,57 5,38 ± 0,09 BT595 cl2 TcV T. i. CHA 7,69 ± 0,45 36,67 ± 0,29 A 1,29 ± 0,01 5,35 ± 0,08 BMA 239 cl2 TcIII D. n. S P 4,94 ± 4,51 32,32 ± 2,87 A 0,93 ± 0,09 6,07 ± 0,07 CJF cl1 N D HUM AMA 8,67 ± 2,05 94,29 ± 13,61 ** 1,84 ± 0,28 5,79 ± 0,12 BT589 TcV T. i. CHA 14,28 ± 1,37 37,52 ± 1,47 ** 2,87 ± 0,68 9,57 ± 1,22 **CON 5 cl2 TcII oTcV T. s. CON < 0,625 28,44 ± 1,49 B <0,156 5,78 ± 0.23 BMA 87 cl1 TcIII D. n. CHA < 0,625 31,47 ± 1,17 B <0,156 6,12 ± 0.01 BT592 cl1 TcV T. i. CHA < 0,625 28,81 ± 2,54 B <0,156 5,23± 0.23 BARMADILLO 9 cl1 TcII D. n. CHA < 0,625 31,19 ± 1,35 B <0,156 6.45 ± 0.02 BMJ cl2 ND HUM ND < 0,625 31,16 ± 1,34 B <0,156 4,68 ± 0,03 CCHACO 32 cl2 TcIII T. i. CHA < 0,625 22,49 ± 2,15 B <0,156 5,19 ± 0,04 CY+ TcII HUM BRA 13,74 ± 5,86 43,74 ± 2,47 REF 1,50 ± 0,26 6,25 ± 0,86 REFCL Brener+ TcVI T. i. BRA 13,16 ± 0,30 39,59 ± 0,91 REF 1,49 ± 0,59 5,61 ± 0,20 REFIC50051015GA GBT589Cl1 REF GA GB GC REFBENZ NFXVeinte aislados de T. cruzi, previamente clonados (5) y provenientes de diferenteshospederos de zonas endémicas para la enfermedad de Chagas en Paraguay, fueronincubados en medio LIT con diferentes concentraciones de nifurtimox y benznidazol, enplacas de 96 pocillos por 72 horas a 28ºC. Cada ensayo se realizó por triplicado. Laviabilidad de los parásitos se determinó por recuento microscópico en cámara de Neubauer(parásitos/ml). La actividad tripanocida de las drogas fue expresada como la concentraciónnecesaria para inhibir el crecimiento del parásito en un 50% y 90% (IC50 e IC90respectivamente). Con los valores obtenidos en el recuento de parásitos se calcularonestos parámetros por un análisis de regresión lineal, utilizando el software Msxlfit™ (IDBusiness Solution, Guildford,UK) y la significancia estadística por el análisis de varianza(ANOVA), con valores de p<0.05, luego de la corrección de Bonferroni, utilizando elsoftware JMP (SAS, Institute).IC900102030405060708090100110GA GB REF GA GB GC REFBENZ NFXGráfico 1.Comparación de los valores de IC50 y de IC90 de los grupos conformados con aislados deTrypanosoma cruzi de Paraguay, en ensayos in vitro con benznidazol y nifurtimox. T589Cl1JFcl1Diagramas en caja mostrando la distribución de los valores de IC50 e IC90, obtenidos de los ensayos realizados por triplicado con cada una de las cepas, según grupo y fármaco. Se indican los percentiles 90 y 10, la mediana y el intérvalo de confianza. BENZ: benznidazol, NFX: nifurtimox, REF: cepas de referencia.CONCLUSIONESLos aislados evaluados fueron más susceptibles al nifurtimox que al benznidazol, con valores de IC50 eIC90 variables entre sí.El análisis estadístico permitió clasificar a las cepas de Paraguay en dos grupos (grupos A y B), condiferencias significativas en cuanto a la susceptibilidad al benznidazol (p<0.0001), y en tres grupos (A, By C) con respecto al nifurtimox (p<0.0001).Estas diferencias en la susceptibilidad no guardaron relación con el UTD, tipo de hospedero yprocedencia.Una cepa aislada de un caso humano fue la que mostró el valor más alto de IC90 (94,29 ± 13,61μg/mL) con el benznidazol, mientras que con una cepa aislada de una vinchuca domiciliar se obtuvieronlos valores más altos de IC50 con ambas drogas testadas (IC50BZ= 14,28 ± 1,37 μg/mL; IC50NX= 2,87 ±0,68 μg/mL).Este estudio refuerza la importancia del estudio de cepas locales en cuanto a la respuesta a la drogas,para un mejor entendimiento del comportamiento biológico de las poblaciones circulantes de T. cruzi ennuestro país, aspecto considerado de relevancia en la epidemiología de esta enfermedad.REFERENCIAS1. World Health Organization. (2015). Chagas disease in Latin America: an epidemiological update based on 2010 estimates. Weekly Epidemiological Record, 90, 33-43.2. Filardi LS, Brener Z (1987).Susceptibility and natural resistance of Trypanosoma cruzi strains to drugs used clinically in Chagas disease.Trans R Soc Trop Med Hyg. 81:755-759.3. Luna KP, Hernández IP, Rueda CM, Zorro MM, Croft SL, Escobar P (2009). In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi strains from Santander, Colombia, to hexadecylphosphocholine (miltefosine), nifurtimox and benznidazole. Biomédica. 29(3):448-55.4. Mejia AM, Hall BS, Taylor MC, Gómez-Palacio A, Wilkinson SR, Triana-Chávez O, Kelly JM (2012). Benznidazole-resistance in Trypanosoma cruziis a readily acquired trait that can arise independently in a single population. J Infect Dis. 206(2):220-8.5. Yeo, M., Lewis, M.D., Carrasco, H.J., Acosta, N., Llewellyn, M., da Silva Valente, S.A.,…Miles, M.A. (2007). Resolution of multiclonal infections of Trypanosoma cruzi from naturally infected triatomine bugs and from experimentally infected mice by direct plating on a sensitive solid medium. nternational Journal for Parasitology, 37(1), 111-120.6. Zingales, B., Miles, M.A., Campbell, D.A., Tibayrenc, M., Macedo, A.M., Teixeira, M.M.,…Sturm NR. (2012). The revised Trypanosoma cruzi subspecific nomenclature: rationale, epidemiological relevance and research applications. Infection, Genetics and Evolution, 12(2), 240-253.UTD: unidades taxonómicas discretas (6). HUM: humano, T.i.: Triatoma infestans, D.n.: Dasypus novemcinctus, E. s.: Euphractus sexcinctus. CHA: Chaco, CON: Concepción, SP: San Pedro, COR: Cordillera, AMA: Amambay, BRA: Brasil. REF: cepas de referencia. ND: no determinado. ** por separado.

Susceptibilidad in vitro de aislados de trypanosoma cruzi circulantes en Paraguay a drogas utilizadas en el tratamiento de la enfermedad de Chagas

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