Immunosuppressant cyclosporine A induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in kidney epithelial cells due to suppression of cyclophilin activity

Abstract

Calcineurin inhibitors (CNI) such as cyclosporine A (CsA) and tacrolimus (Tac), are widely-used as immunosuppressants after solid organ transplantations to prevent allo-graft rejection. However, their therapeutic benefits are limited by nephrotoxicity. In particular, CsA is associated with greater nephrotoxicity than Tac. CNI inhibit calcineurin indirectly by building complexes with different immunophilins: CsA binds to cyclophilins and Tac interacts with the FK506-binding protein (FKBP). These complexes then bind to and inhibit calcineurin. We hypothesized that the stronger nephrotoxicity of CsA may be as-sociated with suppression of cyclophilins, whose chaperone function is crucial in proteo-stasis. Imbalanced proteostasis may lead to endoplasmic reticulum (ER) stress and mal-adaptive unfolded protein response (UPR) in kidney epithelia. To this end, the effects of CsA and Tac treatment (10 μM, for 6 hours each) on UPR and apoptosis markers were evaluated in human embryonic kidney 293 (HEK 293) cells, primary human renal proximal tubular epithelial cells (HRPTEpC) and freshly isolated rat proximal tubules (PT). CsA treatment in cultured cells and isolated PTs induced significant increases to the levels of UPR and proapoptotic markers, whereas Tac treatment resulted in either mild or no effect. Knockdown of cyclophilin A (CYPA) or cyclophilin B (CYPB) via small interfering RNA (siRNA) stimulated proapoptotic UPR and apoptosis, similar to CsA treatment. Concom-itant application of the chemical chaperones tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) or 4-phenylbutyric acid (4-PBA) alleviated CsA-induced ER stress and UPR. Similarly, inacti-vation of critical UPR pathways by CRISPR/Cas9 mediated deletion of protein kinase RNA-like ER kinase (PERK) or activating transcription factor 6 (ATF6) in HEK 293 cells also blunted CsA-induced UPR. In summary, CsA induces stronger expression of UPR and proapoptic markers than Tac, which suggests that higher nephrotoxicity associated with CsA treatment may be, at least in part, derived from the suppression of cyclophilins rather than calcineurin inhibition. In-deed, concomitant treatment with chemical chaperones alleviated the CsA-induced UPR, and genetic suppression of the UPR also blunted the detrimental effects of CsA. Thus, modulation of the UPR may be an effective adjuvant approach to mitigate the nephrotox-icity associated with CsA.Der Einsatz der Calcineurin-Inhibitoren (CNI), Cyclosporin A (CsA) oder Tacrolimus (Tac), gehört zu den Standards bei immunsuppressiver Therapie nach Organtransplan-tation. Die nephrotoxischen Nebenwirkungen von CNI stellen jedoch ein Problem für deren klinische Verwendung dar. Im Vergleich mit Tac hat CsA eine stärker toxische Wirkung. Calcineurin wird durch CNI indirekt über dessen Komplexbildung mit verschiedenen Immunophilinen gehemmt. Dabei bindet CsA an Cyclophiline und Tac an FK506-bindendes Protein (FKBP). Die dadurch entstehenden Komplexe binden dann an Calcineurin und hemmen es. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine angenommene höhere Nephrotoxizität von CsA mit der Unterdrückung von Cyclophilinen in Verbindung steht, weil deren Chaperonfunktion für die Erhaltung der zellulären Proteostase entscheidend ist. Eine unausgeglichene Proteostase kann zu Stress des endoplasmatischen Retiku-lums (ER) und zu maladaptiver Unfolded protein response (UPR) in Nierenepithelien führen. Zur Überprüfung der Hypothese wurden Effekte von CsA und Tac (10 μM, 6 Stunden, jeweils) auf UPR- und Apoptosemarker in humanen embryonalen Nierenzellen 293 (HEK 293), primären humanen proximalen tubulären Nierenepithelzellen (HRPTEpC) und frisch isolierten proximalen Tubuli (PT) von Ratten vergleichend untersucht. Die Behand-lung mit CsA induzierte eine signifikant stärkere Expression von UPR- und Apoptosemar-kern in kultivierten Zellen und isolierten PTs als mit Tac. Die Synthesehemmung (Knock-down) von Cyclophilin A (CYPA) oder Cyclophilin B (CYPB) mittels kleiner interferierender RNA (siRNA) stimulierte proapoptotische UPR und Apoptose in ähnlicher Weise wie die CsA-Behandlung. CsA-induzierte UPR und Apoptose wurden durch die gleichzeitige Anwendung der chemischen Chaperone, Tauroursodeoxycholsäure (TUDCA) oder 4-Phenylbuttersäure (4-PBA), gelindert. In ähnlicher Weise wurden die zelltoxischen Ef-fekte von CsA durch Hemmung der kritischen UPR-Komponenten, Proteinkinase-RNA-ähnliche ER-Kinase (PERK) und Transkriptionsfaktor 6 (ATF6), in HEK 293 Zellen über CRISPR/Cas9-vermittelte Gen-Edition jeweils deutlich gemildert. Zusammenfassend verursacht CsA ein höheres Ausmass an epithelialer UPR und Apoptose als Tac. Die mit CsA-Behandlung einhergehende höhere Nephrotoxizität kommt offenbar anteilig durch Unterdrückung der zugehörigen Cyclophiline zustande. Die Dämpfung der UPR durch chemische Chaperone oder Hemmung ihrer genetischen Kom-ponenten sollte dazu beitragen können, die zelltoxischen Effekte von CsA zu vermindern