Various organic acids have huge potential as industrial platform chemicals. Biotechnological routes of organic acid production are currently being sought, so that fossil resources and petrochemistry could be replaced with renewable resources. Microbial production of organic acids can provide an environmentally sound, sustainable way of producing industrial chemicals, and efficient processes are needed to produce large quantities of acids which are often novel to the production organism. Production of such acids imposes stresses on the organism. These stresses affect the vitality, viability and productivity of the cells in a bioprocess. Understanding the physiology of micro-organisms which have been genetically engineered to produce an organic acid, can make valuable contributions to the development of production organisms for biorefineries, which provide means to convert agricultural and forestry waste into these useful chemicals.
Production of D-xylonate, an industrial platform chemical with high application potential, was successfully demonstrated in various yeast species. D-xylonate is produced from D-xylose via D-xylono-γ-lactone that can be hydrolysed to D-xylonate spontaneously or with the aid of a lactonase enzyme. Various ways to improve production of D-xylonate in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis or Pichia kudriavzevii as production organisms were successfully applied. The best D-xylonate production was obtained by expression of the D-xylose dehydrogenase encoding gene xylB from Caulobacter crescentus and the highest D-xylonate titre was achieved with P. kudriavzevii that produced 171 and 146 g D-xylonate l-1, at a rate of 1.4 or 1.2 g l-1 h-1, at pH 5.5 and pH 3, respectively. Production at low pH is desirable as this would make product recovery and process operations more economically feasible.
The consequences of D-xylonate production on the physiology of S. cerevisiae were studied in detail, both at population and single-cell level. D-xylonate and D-xylono-γ-lactone were produced and also exported from the cells from the very start of cultivation in D-xylose, even in the presence of D-glucose. There was no apparent preference for export of either compound. However, great amounts of D-xylono-γ-lactone and/or D-xylonate was accumulated inside the cells during the production.
The D-xylonolactone lactonase encoding gene xylC was co-expressed with the D-xylose dehydrogenase encoding gene xylB (both genes from C. crescentus). This lead to a significant increase in the D-xylonate production rate compared to cells expressing only xylB and showed that accumulation of D-xylonate and protons releases during hydrolysis, was harmful for the cells. The accumulation of D-xylonate led to acidification of the cytosol, as determined by loss of pHluorin (a pH dependent fluorescent protein) fluorescence, and this loss of fluorescence was faster in cells co-expressing xylC with xylB compared to cells expressing xylB alone. Acidification of the cytosol was shown to correlate with decreased viability of the D-xylonate producing cells and the rate of loss of pHluorin fluorescence and loss in viability was highly dependent on the pH of the production medium. The decrease in vitality and challenges in export of D-xylonate are major obstacles for D-xylonate production by S. cerevisiae. The excellent D-xylonate producer, P. kudriavzevii also accumulated large amounts of D-xylonate and suffered decreased vitality, especially when D-xylonate was produced at low pH.
The stress response to weak organic acids is highly dependent on the properties of the acids and the presence of high concentrations of weak organic acids may lead to lost viability. The role of Pdr12, a membrane transporter, in resistance to weak organic acids was studied and found to be highly dependent on the acid. Deletion of PDR12 led to improved tolerance to formic and acetic acids, a feature that makes this modification interesting for micro-organisms used in biorefining of lignocellulosic hydrolysates that commonly contain these acids.
Biotechnological production of D-xylonic acid with yeast clearly has the potential of becoming an industrially applicable process. In order for biotechnological production processes to become economically feasible, biorefinery approaches in which lignocellulosic hydrolysates or other biomass side- or waste streams are used as raw materials need to be employed. This thesis provides new understanding on how production of an organic acid affects the production host and presents novel approaches for studying and increasing the production.Organiska syror har en enorm potential som industriella plattformskemikalier. En bioteknisk produktion av organiska syror kunde ersätta produktionen av motsvarande, oljebaserade kemikalier. En mikrobiell produktion av organiska syror kan utgöra ett miljövänligt, hållbart sätt att producera kemikalier för industrin. För detta behövs effektiva processer och mikroorganismer med kapacitet att producera stora mängder syror. Dessvärre är syrorna ofta okända för produktionsorganismen och därmed medför produktionen av syra stora påfrestningar, vilket leder till stress. Denna stress påverkar vitaliteten, livskraften och produktiviteten hos cellerna i en bioprocess. Genom att förstå fysiologin hos mikroorganismer som är genetiskt manipulerade för att producera en organisk syra, kan nya produktionsorganismer för bioraffinaderier utvecklas. I ett bioraffinaderi kan jord-och skogsbruksavfall omvandlas till användbara kemikalier.
D-xylonat, en industriell prekursorkemikalie med stor potential, kan produceras med hjälp av olika jästsvampar. D-xylonat framställs från D-xylos via D-xylono-γ-lakton, som kan hydrolyseras till linjär D-xylonat, spontant eller med hjälp av ett laktonas enzym. I denna studie förbättrades produktionen av D-xylonat märkbart med hjälp av jästerna Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis eller Pichia kudriavzevii som produktionsorganismer. Den bästa produktionen av D-xylonat erhölls genom att uttrycka xylB, en gen från Caulobacter crescentus som kodar för ett D-xylos dehydrogenas enzym. Den största D-xylonatproduktionen uppnåddes med P. kudriavzevii, som var kapabel att producera 171 eller 146 g D- xylonat l-1, med en hastighet av 1.4 eller 1.2 g l-1 h-1, vid pH 5.5 respektive pH 3. Det är fördelaktigt att producera syra vid ett lågt pH-värde, eftersom det gör uppsamlandet av syran enklare och därmed processen mer ekonomiskt lönsam.
Konsekvenserna av D-xylonatproduktionen på S. cerevisiae jästens fysiologi studerades i detalj, både på populations- och encellsnivå. Under produktionen samlades stora mängder av D-xylonat och D-xylono-γ-lakton inuti cellerna. Ändå producerades och exporterades D-xylonat från cellerna från början av produktionsprocessen, även i närvaro av D-glukos. Både D-xylonat och D-xylono-γ-lakton exporterades från S. cerevisiae cellerna och det fanns ingen uppenbar preferens för någondera molekylen.
Genom att uttrycka genen som kodar för D-xylonolakton laktonas enzymet, xylC, tillsammans med genen som kodar för D-xylos dehydrogenas enzymet, xylB, fastställdes att ackumulering av linjärt D-xylonat och i hydrolysen frigjorda protoner, var skadligt för cellerna. D-xylonatproduktionen skedde märkbart snabbare i celler som uttryckte både xylB och xylC jämfört med celler som uttryckte endast xylB. Ackumuleringen av D-xylonat ledde till att fluorescensen från pHluorin, ett pH-känsligt fluorescerande protein, försvann. Detta antyder att cellens cytosol försurnade då cellen producerade D-xylonat. Fluorescensen från pHluorin proteinet försvann snabbare i de celler som uttryckte både xylC och xylB, jämfört med de celler som uttryckte endast xylB. Denna försurning av cytosolen visade sig korrelera med en minskad livskraft bland cellerna som producerade D-xylonat och graden av försurning och förminskningen i viabiliteten var starkt beroende av pH-värdet i produktionsunderlaget. En förminskad livskraft och utmaningar i exporten av D-xylonat utgör stora hinder för D-xylonatproduktion med S. cerevisiae. Även i P. kudriavzevii cellerna samlades det stora mängder av D-xylonat och livskraften hos dessa var minskad, speciellt då D-xylonatet producerades vid lågt pH.
Stressreaktionerna gentemot svaga organiska syror är starkt beroende av egenskaperna hos syrorna och höga koncentrationer av svaga organiska syror leder till en förlorad livskraft. Vid studier av den roll transportproteinet Pdr12 har i resistensen mot svaga organiska syror, framkom att syrans egenskaper har stor inverkan på cellernas syratolerans. Mikroorganismer med en deleterad PDR12 gen uppvisade en förbättrad tolerans mot myr- och ättiksyra, vilket kan utnyttjas vid bioraffineringen av lignocelluloshydrolysat, som oftast innehåller dessa syror.
En bioteknisk produktion av D-xylonsyra med hjälp av jästceller har stor potential att bli en industriellt användbar process. För att biotekniska produktionsprocesser skall kunna bli ekonomiskt möjliga, måste man utveckla bioraffinaderier där lignocellulosahydrolysat eller andra sido- eller avfallsströmmar används som råvaror. Denna avhandling ger ny förståelse för hur produktionen av en organisk syra påverkar produktionsorganismen och presenterar nya metoder för att studera och öka produktionen
