Uji Aktivitas Dan Karakterisasi Antimalaria Senyawa Isolat Mikroba Indonesia Melalui Penghambatan Enzim Mitochondria Electron Transport Chain

Abstract

Malaria merupakan penyakit infeksi yang disebabkan oleh parasit dari genus Plasmodium yang disebarkan melalui gigitan nyamuk Anopheles betina. Data WHO menyebutkan terdapat 247 juta kasus malaria pada tahun 2021 pada 84 negara endemik malaria, angka ini meningkat dibandingkan pada tahun 2020 dengan 245 juta kasus. Infeksi malaria mayoritas disebabkan oleh P. falciparum dan P. vivax. Permasalahan saat ini adalah kejadian resistensi Plasmodium terhadap anti-malaria yang telah berkembang secara progresif termasuk pada obat antimalaria lini pertama Artemisisnin, sehingga dibutuhkan pengembangan obat antimalaria baru. Pendekatan pengembangan obat antimalaria adalah dengan pendekatan berbasis target dan pendekatan berbasis sel. Salah satu target potensial adalah jalur Mitochondrial Electron Transport Chain (mtETC) yang penting bagi kehidupan Plasmodium. Pada jalur mtETC Plasmodium terdapat enzim yang berperan penting yaitu dihydroorotate dehydrogenase (PfDHODH) dan Lmalate quinone oxidoreductase (PfMQO). Enzim PfDHODH berperan pada jalur mtETC dalam produksi ATP dan bertanggung jawab pada biosintesis pirimidin parasit. Mekanisme molekular DHODH pada Plasmodium yang berbeda dengan manusia menjadikan PfDHODH sebagai target terapi yang selektif terhadap Plasmodium tanpa mempengaruhi inang. Selain PfDHODH, terdapat enzim PfMQO yang diketahui berperan penting pada tiga jalur metabolisme parasit (ETC, siklus TCA dan siklus fumarat). Selain itu, tidak adanya enzim MQO pada manusia, menjadikan enzim ini memiliki potensi sebagai target pengembangan obat antimalaria yang selektif hanya ditujukan pada Plasmodium tanpa mempengaruhi sel inang. Pada penelitian ini, tes berbasis target (target-based approaches) terhadap enzim PfDHODH dan PfMQO digunakan untuk mendapatkan senyawa antimalaria melalui mekanisme hambatan pada jalur mtETC. Pemanfaatan mikroba telah banyak diteliti dalam pengembangan obat antiparasit, karena keberagaman serta kompleksitas dari senyawa dan kebaruan dalam struktur senyawa. Keberagaman demografi wilayah di Indonesia menjadikan semakin tingginya keberagaman mikroba dan senyawa yang dihasilkan oleh mikroba. Pada penelitian ini menggunakan mikroba (aktinomisetes dan fungi) sebagai sumber bahan penghasil senyawa kandidat obat antimalaria. Desain penelitian terdiri dari dua tahap yaitu: 1) eksploratif dengan pendekatan berbasis target (target-base approaches) untuk mendapatkan senyawa bioaktif dan identifikasi senyawa baru kandidat obat antimalaria, dan 2) uji eksperimental dilakukan untuk mengetahui efikasi senyawa baru kandidat obat antimalaria yang didapat pada tahap 1 penelitian, terhadap enzim target dan kultur Plasmodium secara in vitro. Sebanyak 1600 ekstrak mikroba yang terdiri dari 800 jamur dan 800 aktinomisetes, dilakukan uji terhadap enzim target pada tahap awal skrining. Selanjutnya ekstrak aktif dilakukan pemurnian bertahap dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Kolom Terbuka, Kromatografi Cair Tekanan Tinggi analitik dan preparatif (KCKT analitik dan preparatif), dilanjutkan dengan identifikasi senyawa menggunakan Liquid Chromatography–Mass Spectrometry (LC-MS). Semua langkah pemurnian diikuti dengan pengujian terhadap enzim target. xxi Hasil penelitian didapatkan pada skrining awal ekstrak aktif menghambat PfDHODH (6 ekstrak) dan PfMQO (6 ekstrak). Uji rekonfirmasi dilakukan sehingga di dapatkan hanya satu ekstrak aktif penghambat enzim PfDHODH dan satu ekstrak aktif menghambat enzim PfMQO. Hasil Preliminary extraction test (PET) didapatkan kondisi ekstrak aktif terhadap enzim PfDHODH adalah ekstrak (supernatan fermentasi dengan pelarut butanol pada kondisi pH 2 dari mikroba Aspergillus flavipes BioMCC f.MO200). Sedangkan ekstrak aktif terhadap enzim PfMQO merupakan ekstrak aktif (miselium/biomasa yang diekstraksi dengan pelarut metanol dari mikroba Aspergillus sp. BioMCC f.T.8501). Hasil KLT didapatkan ekstrak Aspergillus flavipes BioMCC f.MO200 tidak menunjukkan pemisahan senyawa yang baik pada seluruh eluen. Sedangkan ekstrak Aspergillus sp. BioMCC f.T.8501 menunjukkan pemisahan senyawa yang baik menggunakan pelarut nonpolar (klorofom 100%). Berdasarkan hasil KLT, dikarenakan pemisahan senyawa sangat baik pada ekstrak Aspergillus sp. BioMCC f.T.8501, selain itu dengan mempertimbangkan fisibilitas proses fraksinasi, dan kebaruan terhadap enzim target PfMQO, karena belum adanya penelitian yang melaporkan hasil purifikasi senyawa dari mikroba sebagai inhibitor PfMQO sehingga isolat ekstrak Aspergillus sp. BioMCC f.T.8501 yang dilanjutkan pada proses purifikasi senyawa. Purifikasi dengan fraksinasi kolom terbuka menggunakan pelarut berdasarkan hasil KLT (resin gel silika dan pelarut klorofom). Semua fraksi kolom silika diuji terhadap enzim PfMQO, sehingga diperoleh fraksi menghambat reaksi enzim PfMQO > 50%. Selanjutnya fraksi aktif dianalisis menggunakan KCKT analitik pada UV detektor 254nm, tampak adanya 5 puncak utama, dengan puncak tertinggi dan terluas pada waktu retensi (RT) 16.769 menit. Selanjutnya, dilakukan pemisahan menggunakan metode KCKT preparatif (memisahkan berdasarkan puncak senyawa pada kromatogram) dan dilakukan uji enzimatik kembali. Didapatkan sebanyak 12 fraksi Aspergillus sp. BioMCC F.T.8501 dengan hasil uji didapatkan fraksi (Fr 5, Fr7, Fr8, Fr9, Fr10 dan Fr12) menunjukkan aktivitas hambatan > 50% terhadap enzim PfMQO. Fraksi 10 (RT 17.527 menit KCKT preparatif dan rt 16.769 KCKT analitik) selanjutnya dipilih untuk dilanjutkan proses purifikasi senyawa. Fraksi 10 hasil KCKT preparatif dipilih dengan mempertimbangkan luas dan tinggi area pada kromatogram yang menunjukkan konsentrasi lebih besar di bandingkan puncak fraksi aktif lainnya. Kromatogram KCKT analitik Fraksi 10 menunjukkan puncak tunggal pada rt 16.801 menit, dengan spektrum UV didapatkan (lmax 213nm, 266nm). Hasil LC-MS didapatkan senyawa dengan formula (C19H15Cl3O5) dan berat molekul (429.00476 m/z) yang dianalisis menggunakan software mzCloud library dan prediksi dengan database Discovery of Natural Product software. Hasil identifikasi berdasarkan formula, berat molekul, spektrum UV dan mikroba yang menghasilkan, maka senyawa tersebut merupakan senyawa nornidulin. Selanjutnya uji eksperimental dilakukan untuk mengetahui efikasi nornidulin dari Aspergillus sp. BioMCC f.T.8501 terhadap enzim PfMQO, kultur P. falciparum 3D7 serta uji toksisitas terhadap sel DLD-1 dan sel vero. Didapatkan hasil Senyawa Nornidulin memiliki aktivitas dalam menghambat aktivitas PfMQO dengan IC50 51 μM dan menghambat pertumbuhan Plasmodium falciparum 3D7 dengan IC50 44.6 μM dan tidak menunjukan efek hambatan sel DLD-1 dan sel vero secara in vitro. Sampai saat ini laporan aktivitas senyawa nornidulin terhadap enzim PfMQO dan kemampuan dalam menghambat pertumbuhan P. falciparum 3D7 secara in vitro belum tersedia. Kesimpulan pada penelitian ini, didapatkan senyawa nornidulin yang merupakan senyawa yang berasal dari mikroba isolat Indonesia Aspergillus sp. BioMCC f.T.8501 yang untuk pertama kalinya dilaporkan sebagai penghambat PfMQO, serta mampu menghambat proliferasi P. falciparum 3D7, tetapi tidak sel DLD-1 dan sel Vero dengan indeks selektivitas lebih dari 10x. Hal ini menunjukkan potensi strain mikroba Indonesia sebagai sumber penemuan obat antimalaria yang menjanjikan