Prolyl oligopeptidase (PREP) is a serine endopeptidase that has the ability to cleave short proline-containing peptides at the carboxyl side of proline. It consists of a catalytic domain and a β-propeller domain, with a relatively large cavity between them. The proteolytic active site is located within this cavity, and the binding mode of peptidic PREP substrates and inhibitors is well understood based on the information from several crystal structures. A large range of peptide-like PREP inhibitors mimicking its suggested endogenous substrates have been developed, and the structure-activity relationship (SAR) for inhibitors has been thoroughly characterized. Early in vitro studies suggested that PREP might regulate neuropeptide levels in the brain, but in vivo evidence of this is lacking. More recently, PREP has been shown to be involved in several protein-protein interactions (PPIs), and the primary functions of PREP are now believed to be mediated through these interactions. Two very interesting interaction partners for PREP are α-synuclein (αSyn) and protein phosphatase 2 A (PP2A). The interaction with αSyn has been shown to increase αSyn dimerization, something that is characteristic of synucleopathies such as Parkinson’s disease. The interaction with PP2A has been shown to result in PP2A inactivation, which in turn leads to reduced PP2A mediated autophagy, increased reactive oxygen species (ROS) production, and reduced Tau and αSyn dephosphorylation, which are all processes commonly associated with neurodegenerative diseases (NDDs). Certain PREP inhibitors have been shown to have an effect on the PPI-mediated functions of PREP, and importantly, the ability to modulate these functions does not correlate with the ability to inhibit PREP. KYP-2047 is one of the inhibitors that also affects the PPI-mediated functions, reducing αSyn and Tau aggregation, increasing αSyn and Tau clearance through increased autophagy, and reducing ROS production, both in vitro and in vivo.
The starting point for this doctoral thesis was a recently published series of peptide-like PREP ligands, where the electrophilic group of covalently binding PREP inhibitors had been replaced with a tetrazole group. Some of these compounds were low nanomolar PREP inhibitors, but more importantly, several of the compounds with practically no effect on the proteolytic activity of PREP were very effective at reducing αSyn dimerization, and further investigation of this disconnect in SARs was needed. The first series presented here is also a peptide-like series, where the tetrazole group of the above mentioned series was replaced with various other nitrogen-containing 5-membered heteroaromatic rings. Several of the newly synthesized ligands demonstrated a similar disconnect in SARs for inhibition of PREP and modulation of its PPI-mediated functions. Surprisingly, when the tetrazole group was changed to a 2-imidazole group, the inhibitory activity of the compounds improved significantly, and docking studies revealed a previously unpublished potential binding interaction at the proteolytic active site of PREP. The other ligand series presented here are all non-peptidic, and differ significantly from any previously published PREP ligands. The first of these is based around a 5-aminooxazole scaffold, which was initially discovered as a side product during the synthesis of the tetrazole-containing ligand series. Surprisingly, despite lacking the two carbonyls that are crucial for the inhibitory activity of peptide-like ligands, several of the 5-aminooxazoles are low nanomolar inhibitors. Additionally, several of the compounds have significant activity in modulating both αSyn dimerization and autophagy in vitro, outperforming the in vivo active reference compound KYP-2047 in our assays. Four series based on aromatic bioisosteres of oxazole: thiazole, triazole, oxadiazole, and pyrimidine, were then synthesized to gain information on the SAR of the newly discovered scaffold. Almost all of the compounds in these series were very weak inhibitors of PREP, but all series contained compounds that could modulate at least one of the PPI-mediated functions of PREP. Further assays with thiazole HUP-46 and oxazole HUP-55 demonstrated that their effect on the PPI-mediated functions is concentration-dependent and likely the result of an interaction with PREP, as they have no effect in PREP knock-out cells. In mouse models, HUP-55 passed the blood-brain barrier, decreased αSyn aggregates in the brain, and had a disease modifying effect on behaviour in an αSyn virus vector model.
In an attempt to understand the disconnected SARs for inhibition of PREP and modulation of its PPI-mediated functions, we searched for a second binding site inside the cavity of PREP, which we considered the most likely origin of the observed disconnect. One promising site was identified using molecular modelling and further studied using point-mutations. Binding assays revealed that the point-mutations at the postulated second binding site weakened the binding of compounds that can modulate the PPI-mediated functions of PREP, but had little to no effect on a potent PREP inhibitor that cannot modulate these functions. These results support our hypothesis of the existence of a second binding site, which is clearly separate from the proteolytic active site. Further investigation of this second binding site is crucial to understanding how PREP can be effectively targeted, ideally leading to disease modifying effects on a variety of NDDs.Prolyylioligopeptidaasi (PREP) on seriiniendopeptidaasi, joka kykenee pilkkomaan lyhyitä proliinia sisältäviä peptidejä proliinin karboksyylipäästä. PREP koostuu kahdesta domeenista, joista toinen on katalyyttinen domeeni ja toinen β-propellirakenteinen domeeni. Domeenien välissä on suhteellisen suuri onkalo, jossa myös katalyyttinen kohta sijaitsee. PREP:in substraattien ja substraatteja matkivien peptidimäisten inhibiittoreiden sitoutumismoodi aktiiviseen kohtaan tunnetaan hyvin usean kiderakenteen perusteella ja peptidimäisten inhibiittoreiden rakenne-aktiivisuussuhde on laajalti selvitetty monien yhdistesarjojen avulla. Ensimmäiset in vitro tutkimukset osoittivat, että monet neuropeptidit olisivat PREP:in substraatteja, mutta inhibiittoreiden vaikutusta neuropeptidien tasoihin aivoissa ei ole monista yrityksistä huolimatta pystytty osoittaman in vivo. PREP:n on myöhemmin osoitettu osallistuvan useaan proteiini-proteiini vuorovaikutukseen (PPI; engl. protein-protein interaction), ja PREP:n fysiologisesti tärkeimmän vaikutuksen uskotaan tulevan näiden interaktioiden kautta. Kaksi hyvin mielenkiintoista interaktioparia PREP:ille ovat α-synukleiini (αSyn) ja proteiinifosfataasi 2A (PP2A). Interaktio αSyn:n kanssa on osoitettu lisäävän αSyn:n dimerisaatiota, joka on mahdollisesti hermosolutoksisuuden takana synukleopatioissa kuten Parkinsonin taudissa. Interaktio PP2A:n kanssa on osoitettu inaktivoivan PP2A:ta, mikä vähentää PP2A-välitteistä solujen kierrätyskeskuksen, autofagian, toimintaa, lisää reaktiivisten happiradikaalien tuotantoa, ja lisää Taun ja αSyn:n kertymistä fosforylaation kautta. Nämä kaikki ovat yleisiä prosesseja neurodegeneratiivisissä sairauksissa. Tietyt PREP-inhibiittorit, kuten esim. KYP-2047, voivat kuitenkin säädellä PREP:in PPI-välitteisiä vaikutuksia, mutta kyky säädellä näitä vaikutuksia ei korreloi niiden kykyyn inhiboida PREP:n proteolyyttistä aktiivisuutta.
Lähtökohta tälle tutkimukselle oli tutkimusryhmän aiemmin julkaisema sarja peptidinkaltaisia PREP-ligandeja, joissa kovalenttisesti sitoutuvien PREP ligandien elektrofiilinen ryhmä oli korvattu tetratsoliryhmällä. Osa näistä yhdisteistä oli hyvin tehokkaita proteolyyttisen aktiivisuuden inhibiittoreita. Mielenkiintoisempaa kuitenkin oli, että tämän yhdistesarjan monella hyvin heikolla proteolyyttisen aktiivisuuden inhibiittorilla oli voimakas αSyn-dimerisaatiota vähentävä vaikutus. Tämä eroavaisuus proteolyyttisen aktiivisuuden ja PPI-välitteisten funktioiden rakenne-aktiivisuussuhteissa kaipasi lisätutkimuksia. Tässä tutkielmassa ensimmäiseksi esitetty yhdistesarja oli myös peptidinkaltainen sarja, jossa yllä mainittu tetratsoli oli korvattu usealla erilaisella typpeä sisältävällä viiden atomin kokoisella heteroaromaattisella renkaalla. Useampi tämän sarjan ligandeista osoitti myös toisistaan eroavat rakenne-aktiivisuussuhteet proteolyyttisen aktiivisuuden inhibitioon ja PPI-välitteisiin vaikutuksiin. Yllättäen, kun tetratsoliryhmä muutettiin 2-imidatsoliryhmään, yhdisteen inhiboiva aktiivisuus kasvoi merkittävästi. Tietokoneavusteinen telakointitutkimus paljasti mahdollisen sitoutumisvuorovaikutuksen PREP:in aktiivisessa kohdassa, jota ei oltu ennen julkaistu. Työn seuraavassa vaiheessa lähtökohdaksi otettiin ryhmän aiemmin löytämää 5-amino-oksatsolirakenteista molekyyliä, joka oli havaittu sivutuotteena tetratsolisarjan yhdisteitä syntetisoidessa. Tämän yhdisteen rakenne erosi huomattavasti mistään aikaisemmin julkaistusta PREP-ligandista. Yllättäen, vaikka näistä yhdisteistä puuttuu kaksi karbonyyliryhmää, jotka ovat olennaisia peptidin kaltaisten ligandien inhiboivaan aktiivisuuteen, useampi 5-amino-oksatsolisarjan yhdisteistä osoittautui proteolyyttisen aktiivisuuden nanomolaarisiksi inhibiittoreiksi. Useampi yhdiste myös osoitti merkittävää aktiivisuutta αSyn-dimerisaation ja autofagian moduloinnissa in vitro. Osalla yhdisteillä tämä vaikutus oli jopa tehokkaampi kuin esim. KYP-2047:lla, joka on osoittanut tehonsa myös in vivo malleissa. Tämän jälkeen syntetisoitiin neljä yhdistesarjaa perustuen oksatsolin aromaattisiin bioisosteereihin: tiatsoliin, triatsoliin, oksadiatsoliin ja pyrimidiiniin. Näiden avulla oli tarkoitus saada lisää tietoa uuden molekyylirangan rakenne-aktiivisuussuhteesta. Lähes kaikki yhdisteet uusissa yhdistesarjoissa olivat hyvin heikkoja PREP:in proteolyyttisen aktiivisuuden inhibiittoreita, mutta jokaisesta yhdistesarjasta löytyi yhdisteitä, joilla pystyttiin säätelemään vähintään yhtä PREP:n PPI-välitteisistä vaikutusta. Lisätutkimukset tiatsolilla HUP-46 ja oksatsolilla HUP-55 osoittivat, että niiden vaikutus PPI-välitteisiin funktioihin on konsentraatiosta riippuvainen ja tulee todennäköisesti PREP:n kautta, sillä niillä ei ollut tehoa soluissa, joista PREP oli poistettu. Hiirimalleissa HUP-55 läpäisi aivo-veri esteen, vähensi αSyn kertymiä aivoissa, ja vaikutti käyttäytymisen perusteella taudin kehittymiseen αSyn virusvektorimallissa.
Yrittääksemme ymmärtää eroavaisuuksia proteolyyttisen inhibition ja PPI-välitteisten vaikutusten säätelyn rakenne-aktiivisuussuhteissa, etsimme PREP:in onkalosta toista sitoutumispaikkaa. Lupaava sitoutumispaikka löytyi molekyylimallinnuksen avulla, ja lisätutkimuksia suoritettiin pistemutaatioita hyödyntäen. Sitoutumiskokeet paljastivat, että pistemutaatiot ehdotetussa toisessa sitoutumispaikassa heikensivät PPI-välitteisiä vaikutuksia säätelevien yhdisteiden sitoutumista, heikentämättä kuitenkaan sitoutumista yhdisteelle, joka on tehokas PREP:in proteolyyttisen aktiivisuuden inhibiittori, mutta ei kykene säätelemään sen PPI-välitteisiä vaikutuksia. Nämä tulokset tukevat hypoteesia aktiivisesta kohdasta selvästi erillään olevasta toisen sitoutumispaikan olemassaolosta. Lisätutkimusta tästä toisesta sitoutumispaikasta tarvitaan, että ymmärretään, kuinka PREP:n funktioita voidaan tehokkaasti säädellä erilaisilla pienmolekyylisillä ligandeilla. Tämä taas voisi parhaassa tapauksessa johtaa tehokkaisiin yhdisteisiin, joita voitaisiin mahdollisesti käyttää usean eri hermorappeumasairauden hoitoon
