Développement d’un biocapteur au sulfure d’hydrogène

Abstract

Beyond its poisonous, corrosive, flammable and rotten odor properties, hydrogen sulfide (H2S) has recently been found to be a major gaseous transmitter in humans, in the same way as nitric oxide and carbon monoxide. Accurate detection of the low H2S concentrations present in biological media with an analytical tool, exhibiting appropriate sensitivity and specificity, is however still missing, restricting thus the characterization of the biological role of H2S and its possible involvement in pathologies. In this context, we propose here an innovative opto-electrochemical biosensor that combines the high specificity and affinity of a H2S-bioreceptor probe with the sensitivity of a 3D transparent metal oxide electrode. Our interest has notably been focused on a peculiar H2S-sensitive hemoprotein, the hemoglobin I (HbI) which, on account of its original heme pocket organization, shows particularly high specificity and affinity binding towards H2S. Upon reversible coordination of H2S to the ferric heme center, variations in the spectroscopic and electrochemical features of the protein offer original real-time, specific and sensitive H2S monitoring. To develop our biosensor, we decided to take advantage of a transparent and fully conductive mesoporous metal-oxide electrode based on ITO (indium tin oxide) which preparation by glancing angle vapor deposition - GLAD allows for excellent control of the morphology (film thickness and porosity) and reproducibility. This three-dimensional matrix allows for adsorption of large amounts of biological molecules without significant denaturation and up to a concentration easily detected by spectroscopy, as well as direct electron transfer in some cases. In order to prepare stable modified nanostructured electrodes, we have explored a two-steps covalent functionalization of the ITO surface by first introducing carboxyl functional groups by electrochemical reduction of in-situ generated diazonium salts, followed by covalent peptidic coupling of the hemoglobin I through the surface-accessible lysine residues. The resulting hemoglobin I-modified electrodes were characterized by different techniques. They exhibit excellent stability in solution, even in high ionic strength aqueous solutions. We further demonstrated that reversible H2S fixation can be monitored by simple UV-visible absorption spectroscopy, with excellent affinity and real time detection in the micromolar range. Furthermore, the high selectivity compared to other biological thiols (cysteine, glutathione) allows multiple biosensor application, hence achieving the device valorization.Au-delà de son caractère polluant, hautement toxique et son odeur d'oeuf pourri il est désormais démontré que le sulfure d'hydrogène, H2S, est également un transmetteur gazeux chez les mammifères aussi important que le monoxyde d'azote et le monoxyde de carbone. Cependant, et malgré de nombreuses avancées récentes, il n'existe toujours pas d'outils analytiques permettant une détection sensible, spécifique et en temps réel du sulfure d'hydrogène dans les milieux biologiques. Un tel dispositif permettrait notamment de valider l'implication d'H2S dans certaines pathologies, ouvrant ainsi la voie à une utilisation pharmacologique de cette molécule. Nous proposons dans ce travail de doctorat de développer un biocapteur opto-électrochimique innovant, combinant l'extrême affinité et spécificité d'une sonde biologique avec la sensibilité d'une électrode d'oxyde métallique, 3D et transparente. Pour cela, notre attention s'est portée sur une hémoglobine particulière, l'hémoglobine I (HbI), qui présente à travers l'organisation et la composition originale de la poche de l'hème, une affinité et une spécificité de liaison avec H2S très favorable. Les variations des propriétés spectroscopiques et électrochimiques de la protéine induites par la coordination d'H2S au centre ferrique de l'hème, permettent une détection originale en temps réel, sensible et spécifique du H2S. Pour développer ce biocapteur, nous avons tiré parti d'électrodes mésoporeuses conductrices et transparentes constituées d'oxyde d'indium dopé à l'étain (ITO), préparées par méthode de déposition physique (GLAD - GLancing Angle Deposition) offrant un excellent contrôle de la morphologie du film mésoporeux (épaisseur et porosité du film) et excellente reproductibilité. La tri-dimensionnalitée du réseau GLAD ITO permet l'immobilisation non dénaturante, d'une grande quantité biomolécules, facilitant la détection spectroscopique ainsi que, dans certains cas, un transfert d'électron direct. Pour la modification des électrodes nanostructurées, nous avons développé une méthodologie en deux étapes, avec d'une part l'introduction de fonctions carboxyles par réduction électrochimique in situ de sels d'aryldiazoniums puis un couplage peptidique de l'hémoglobine I avec les amines primaires des résidus lysines de surface. Les électrodes GLAD ITO/HbI modifiées ont par la suite été caractérisées par différentes techniques. Leurs stabilités en solution aqueuse, même à des forces ioniques élevées, est excellente. De plus nous avons démontré que la fixation rapide, réversible et sélective d'H2S à HbI immobilisée peut être suivie par simple spectroscopie d'absorption UV-visible ouvrant la voie à des analyses en temps réel. L'affinité pour H2S de l'électrode modifiée, de l'ordre du micromolaire et la spécificité du biocapteur vis-à-vis des autres thiols biologiques (cystéine, glutathion) permettent d'envisager de multiples applications valorisant ainsi le dispositif développé

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