Etude de la séparation de phase liquide-liquide et du chaperon d'histone fact dans l'organisation du compartiment de réplication de l'adénovirus de type 5

Abstract

Adenovirus is a double stranded DNA virus which is used as a viral vector vaccine. Its genome is highly compacted inside the viral particle and organized into chromatin by virtue of the protein VII. Nuclear genome delivery in a target cell is followed by decompaction and partial eviction of protein VII and the deposition of cellular histones to initiate viral genes transcription and then the viral DNA replication. At late stages the process is reversed and viral genomes are condensed and packaged into a chromatin associated with proteins VII and without cellular histones. Few factors involved in driving this reversible chromatinization of the adenoviral genome are known. Potential candidates involve cellular histone chaperons, which are classed into three different groups acting replication dependent, replication independent or following DNA repair. Viral genome replication occurs in virus induced membraneless organelles called viral replication compartment (RC) formedwith host factors and viral proteins like the viral DBP (DNA Binding Protein) protein. RCs are morphologically dynamic and two distinct RCs can be distinguished. Early RCs are presumed to replicate genomes for gene expression while late RCs surround bodies called viral induced post replication bodies (ViPR bodies) which are the site of viral genome accumulation likely for their encapsidation into new viral particles. We tried to elucidate the mechanism driving RC and ViPR bodiesformation and what allows the recruitment or exclusion of both host and viral proteins which can be necessary for the reversible viral genome chromatinization. Mechanisms involved are likely liquid-liquid phase separation (LLPS). LLPS is a reversible physical process permitting the enrichment and depletion of factors within two functional separate phases formed by weak interactions between proteins and nucleic acids. It can explain the adenoviral RC formation. In this work, we have shown that RCs are histone free, exclude host chromatin and that histone chaperones including FACT (FAcilitates Chromatin Transcription) are specifically associated with RCs. FACT accumulates in RC and its SSRP1 subunit drives phase separation suggesting a role in Adenovirus RC formation and genome replication and/or transcription possibly by reversible genome chromatinization. This work will allow to better understand the fate of the adenoviral genome in the infected cell and to improve potentially adenoviral based vectors. This thesis work also focused on the study of SARS-CoV-2 which can cause acute respiratory distress syndrome with a high degree of mortality in elderly patients. We established functional reconstitutedprimary bronchial epithelia (BE) derived from donors (adults and children) to study SARS-CoV-2 infection in a physiologically relevant model. We identified multi-ciliated cells as the primary target cells for SARS-CoV-2. We further observed rapid viral spread throughout the entire BE within 24-48 hours. Within 3-4 days, we observed syncytia formation between ciliated cells and basal cells which accumulate at the apical side of the BE. We show that infected cells including syncytia are releasedinto the apical lumen and contribute to the transmittable virus dose. Interestingly, some BE mainly reconstituted from young donor, showed an intrinsic resistance to infection and virus spread. This restricted infection phenotype correlated with a faster release of type-III interferon secretion. Moreover, exogenous type-III interferon treatment to permissive epithelia installed infection restriction while interferon gene knockout promoted infection. Taken together our data uncover syncytia formation as possible contribution to tissue or environmental SARS-CoV-2 dissemination and the type-III IFN response as a central contributor to SARS-CoV-2 resistance in BE, which may explain epidemiological observations that SARS-CoV-2 fatality is age dependent.L’Adénovirus est un virus à ADN double brin qui est utilisé comme vecteur vaccinal. Son génome est très compacté à l’intérieur de la particule virale et il est organisé en chromatine grâce à son association avec la protéine virale VII. La libération du génome viral dans le noyau d’une cellule cible est suivie par sa décompaction, par l’éviction partielle de protéines VII et le dépôt d’histones cellulaires afin d’initier la transcription des gènes viraux puis la réplication de l’ADN viral. A un stade plus tardif, ce processus est inversé et les génomes viraux sont condensés et compactés en chromatine associée à la protéine VII et dépourvue d’histones cellulaires. A l’heure actuelle, peu de facteurs impliqués dans cette chromatinisation réversible du génome adénoviral sont connus. Ces facteurs sont probablement les chaperons d’histone cellulaires, classés en trois groupes différents agissant de manière dépendante ou non de la réplication, ou durant la réparation de l’ADN. La réplication de l’ADN viral s’effectue à l’intérieur d’organelles non-membranaires induites par le virus et nommées compartiments de réplication viraux (CR). Les CR sont formés par des facteurs de l’hôte et par des protéines virales comme la protéine de réplication virale DBP (DNA Binding Protein). Les CR sont morphologiquement dynamiques et deux types de CR distincts peuvent être distingués. Les CR précoces sont supposés répliquer les génomes pour l’expression des gènes viraux tandis que les CR tardifs entourent des corps appelés corps viraux induits après la réplication (ViPR bodies en anglais) qui sont le site d’accumulation de génomes susceptibles d’être encapsidés dans les nouvelles particules virales. Nous avons essayé d’élucider le mécanisme à l’origine de la formation des CR et des ViPR et ce qui permet le recrutement ou l’exclusion des protéines de l’hôte et des protéines virales, qui pourrait être nécessaire à la chromatinisation réversible des génomes viraux. Les mécanismes impliqués sont probablement la séparation de phase liquide-liquide (LLPS). La LLPS est un processus physique réversible permettant l’enrichissement et l’appauvrissement en facteurs au sein de deux phases fonctionnelles distinctes formées par de faibles interactions entre des protéines et des acides nucléiques. Elle pourrait expliquer la formation des CR de l’Adénovirus. Dans ce travail, nous avons montré que les CR sont dépourvus d’histones cellulaires, qu’ils excluent la chromatine de l’hôte et que des chaperons d’histones incluant FACT (FAcilitates Chromatin Transcription) y sont spécifiquement associés. FACT s’accumule dans les CR et sa sous-unité SSRP1 induit de la séparation de phase suggérant un rôle dans la formation des CR de l’Adénovirus et la réplication et/ou la transcription du génome viral probablement par la chromatinisation réversible du génome viral. Ce travail permettra de mieux comprendre le devenir du génome adénoviral dans la cellule infectée et potentiellement d’améliorer encore les vecteurs basés sur les Adénovirus