Κυτταρικός επαναπρογραμματισμός καλείται η διαδικασία κατά την οποία διαφοροποιημένα, σωματικά κύτταρα μετατρέπονται σε επαγόμενα πολυδύναμα κύτταρα (iPSCs), όμοια με τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ESCs), μέσω της εξωγενούς έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων Oct4, Sox2, Klf4 και c-Myc (παράγοντες OSKM). Κατά τη διαδικασία αυτή πραγματοποιούνται ραγδαίες αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση και επιγενετική ρύθμιση με στοχαστικό τρόπο. Τεχνολογίες υψηλής ανάλυσης χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση πιθανών ρυθμιστικών στοιχείων κατά τον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό. Προηγούμενα πειράματα ChIP-seq του εργαστηρίου υπέδειξαν την πρόσδεση των παραγόντων OSKM σε συγκεκριμένες περιοχές ανοδικά των γονιδίων Lefty1, Pou5f1 (Oct4) και Upp1. Υποθέσαμε ότι τα στοιχεία αυτά αποτελούν ρυθμιστικές αλληλουχίες οι οποίες ελέγχουν την έκφραση των παρακείμενων γονιδίων κατά τον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό. Στην παρούσα εργασία μελετήσαμε τις περιοχές αυτές, κατασκευάζοντας λεντιϊκά συστήματα έκφρασης του γονιδίου αναφοράς της GFP υπό τον έλεγχο του κάθε πιθανού ρυθμιστικού στοιχείου. Τα συστήματα αυτά εισήχθησαν σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού (MEFs) που στη συνέχεια επαναπρογραμματίστηκαν. Ανακαλύψαμε ότι οι περιοχές αυτές, πράγματι, λειτουργούν ως ενισχυτές επάγοντας την έκφραση του γονιδίου αναφοράς κατά τη διάρκεια του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού. Συγκριτικές μελέτες της έκφρασης του γονιδίου αναφοράς με το εκάστοτε ενδογενές γονίδιο έδειξαν πως μόνο η ρυθμιστική περιοχή ανοδικά του γονιδίου Upp1 μπορεί να μιμηθεί το ενδογενές πρόγραμμα του κυττάρου. Συνεπώς, καταφέραμε να ταυτοποιήσουμε τον ενισχυτή, ο οποίος ελέγχει την έκφραση του γονιδίου Upp1 κατά τον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό. Το στοιχείο αυτό μπορεί να αποτελέσει σημαντικό εργαλείο για την απομόνωση επαναπρογραμματιζόμενων κυττάρων, με σκοπό τον καθορισμό των μοριακών και βιοχημικών υπογραφών τους, που θα ενισχύσουν τη γνώση γύρω από το φαινόμενο του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού.Cellular reprogramming is the process during which differentiated, somatic cells turn into induced pluripotent stem cells (iPSCs), similar to embryonic stem cells (ESCs), through exogenous expression of the transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc (OSKM factors). During this process rapid changes in gene expression and epigenetic regulation take place in a stochastic way. High-throughput technologies are being used for the identification of possible regulatory elements during cellular reprogramming. Previous ChIP-seq experiments in the lab have shown the binding of the OSKM factors to specific regions upstream of the genes Lefty1, Pou5f1 (Oct4) and Upp1. It was assumed that these elements are regulatory sequences, that control the expression of the downstream genes during the course of reprogramming. In the present thesis, we studied these regions by constructing lentiviral expression systems of the GFP reporter gene, under the control of each putative regulatory element. These systems were introduced into mouse embryonic fibroblasts (MEFs), that were further used in reprogramming experiments. We discovered that these regions actually function as enhancers, inducing the expression of the reporter gene during reprogramming. Comparative expression studies between the reporter gene and the corresponding endogenous gene have shown that only the induction of the regulatory region upstream of the Upp1 gene can imitate the endogenous cell program. In conclusion, we have managed to identify the enhancer, that controls the expression of the Upp1 gene during cellular reprogramming. This element can be a powerful tool for the isolation of reprogrammed cells, in order to determine their molecular and biochemical signatures, increasing our knowledge on cellular reprogramming
