BAĞ ALANLARINDA ÖLÜKOL HASTALIĞI ETMENİ PHOMOPSİS VİTİCOLA (SACC.) SACC. İZOLATLARINDAKİ DSRNA’NIN TANILANMASI, MOLEKÜLER VE BİYOLOJİK KARAKTERİZASYONU İLE HİPOVİRÜLENT ETKİSİ

Abstract

BAĞ ALANLARINDA ÖLÜKOL HASTALIĞI ETMENİ PHOMOPSİS VİTİCOLA (SACC.) Sacc. İZOLATLARINDAKİ DSRNA’NIN TANILANMASI, MOLEKÜLER VE BİYOLOJİK KARAKTERİZASYONU İLE HİPOVİRÜLENT ETKİSİ Hosseinalizadeh S. Aydın Adnan Menderes Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Bitki Koruma Programı, Doktora Tezi, Aydın, 2021. Amaç: Ege Bölgesinin bağ alanlarında Phomopsis sürgün ve yaprak lekesi (ölükol) hastalığı etmeni Phomopsis viticola izolatlarında dsRNA’nın tanılanması, moleküler ve biyolojik karakterizasyonu ile hipovirülent etkisisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Materyal ve Yöntem: 2018 yılında Ege Bölgesinin en fazla asma yetiştiriciliği yapılan il ve ilçelerden ölükol hastalığı belirtisi sergileyen asmaların sürgün örneklerinden elde edilen fungal izolatların morfolojik ve kültürel özellikleri değerlendirilerek P. viticola etmeni moleküler yöntemlerle tanılanmıştır. P. viticola izolatlarından Balijja vd. (2008) yöntemi ile dsRNA analizi yapılıp, dsRNA içeren izolatlar dsRNA içermeyen 3 izolat ile biyolojik özellikleri yönünden karşılaştırılmıştır. Seçilen dsRNA içeren 50 izolatın dikey taşınma kapasitesi en iyi performans gösteren izolatlar ile asma fidanların üzerinde virülenslik testleri yapılmıştır. dsRNA içeren izolatların vegetatif uyum grupları belirlenmiş ve yatay taşınım kapasiteleri değerlendirilmiştir. Yatay taşınım ile dsRNA pozitife dönüştürülen virülent P. viticola izolatlarında dsRNA virüslerin hipovirulenslik etkisi asma fidanları üzerinde belirlenmiştir. Tüm uygulanan biyolojik testlerde en iyi performans göstermesi nedeniyle biyolojik mücadelede kullanılabilme özelliği taşıyan 6 adet izolat arasından seçilen 2 izolata ait dsRNA’ları tüm genom dizi analizi yeni nesil dizileme teknolojisi (YND) Illumnia sekanslayıcıda yapılmıştır. Çift yönlü okumaların birleştirlmesiyle de novo tüm genom dizisi belirlenmiş ve filogenetik analizleri yapılmıştır.İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY ....................................................................................................................i TEŞEKKÜR ...............................................................................................................................ii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ.............................................................................vii ŞEKİLLER DİZİNİ...................................................................................................................ix RESİMLER DİZİNİ...................................................................................................................x ÇİZELGELER DİZİNİ.............................................................................................................xv ÖZET.....................................................................................................................................xviii ABSTRACT .............................................................................................................................xx 1. GİRİŞ......................................................................................................................................1 2. KAYNAK ÖZETLERİ...........................................................................................................8 2.1. Phomopsis viticola Etmeninin İsimlendirilmesi ve Dünyada Yapılan Çalışmalar..............8 2.2. Türkiye Bağ Alanlarında Ölükol Hastalığı (Phomopsis viticola ) ....................................11 2.3. Ölükol Hastalığı ile Mücadele...........................................................................................12 2.4. Phomopsis Türlerinde Mikovirüs Çalışmaları...................................................................14 2.5. Türkiye’de Mikovirüsler Üzerinde Çalışmalar: ................................................................19 2.6. Yeni Nesil Gen Dizileme Teknolojilerinin Virüs ve Mikovirüslerin Tanılanmasında Kullanımı ........................................................................................................................21 3. MATERYAL VE YÖNTEM ...............................................................................................24 3.1. Materyal.............................................................................................................................24 3.2. Yöntem ..............................................................................................................................24 3.2.1. Ölükol Hastalığı Belirtileri Sergileyen Omcalardan Fungal Örneklerin Elde Edilmesi ..........................................................................................................................24 3.2.2. Fungal Örneklerin İzolasyonu, Saflaştırması ve Miselyal Koloni Değerlendirmeleri ...27 3.2.3. Fungal İzolatların Kültürel Özelliklerinin Değerlendirilmesi ........................................28 iv 3.2.3.1. Miselyal Gelişimleri ve Koloni Gelişme Hızları.........................................................28 3.2.3.2. Piknit Oluşumu............................................................................................................29 3.2.3.3. Koloni Renkleri ve Spor Oluşumları...........................................................................30 3.2.4. Fungal İzolatların Moleküler Tanısı...............................................................................31 3.2.4.1. Phomopsis viticola’nın DNA İzolasyonu....................................................................31 3.2.4.2. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)...........................................................................32 3.2.5. Fungal İzolatlarda dsRNA Varlığının Belirlenmesi .......................................................33 3.2.6. dsRNA Pozitif izolatların Biyolojik Yönden Karakterizasyonu ....................................35 3.2.6.1. dsRNA İçeren ve İçermeyen Phomopsis viticola İzolatlarının Kültürel Özelliklerinin Karşılaştırılması .......................................................................................35 3.2.7. dsRNA Pozitif İzolatların Dikey Taşınma Kapasitesinin Ölçülmesi .............................35 3.2.8. dsRNA Pozitif Phomopsis viticola İzolatların Virülenslik Durumunun Belirlenmesi...37 3.2.8.1. Asma Bitkilerinin Yetiştirilmesi..................................................................................37 3.2.8.2. dsRNA Pozitif Phomopsis viticola İzolatlarından İnokulum Hazırlanması................38 3.2.9. dsRNA Pozitif Phomopsis viticola İzolatlarında dsRNA’nın Yatay Taşınmı................40 3.2.9.1. İzolatların Vejetatif Uyum (vc) Tiplerinin Belirlenmesi.............................................40 3.2.9.2. dsRNA Pozitif Phomopsis viticola İzolatlarının Yatay Taşınım Çalışmaları .............41 3.2.10. dsRNA Virüslerinin Hipovirulenslik Üzerine Etkisi (2. Aşama Virülenslik Testleri)...........................................................................................................................42 3.2.11. Moleküler Karakterizasyon ..........................................................................................43 3.2.11.1. dsRNA’nın Ekstraksiyon...........................................................................................44 3.2.11.2. dsRNAnın Genom Dizi Analizi.................................................................................47 3.2.11.2.1. dsRNA Miktar ve Kalitesinin Belirlenmesi ...........................................................47 3.2.11.2.2. dsRNA Örneklerinin Saflaştırılması.......................................................................47 3.2.11.2.3. dsRNA Dizileme Çalışmaları.................................................................................48 3.2.11.3. dsRNA’nın Biyoinformatik Analizi ..........................................................................48 3.2.11.3.1. De novo assembly Çalışmaları ...............................................................................49 v 3.2.11.3.2. Birleştirme (Assembly) Doğrulaması.....................................................................50 3.2.11.3.3. Genom tahmini (Gene Prediction) ve annotasyonu................................................51 3.2.11.3.4. BLAST Analizleri ve Filogenetik Ağaç Çizimi .....................................................51 4. BULGULAR ........................................................................................................................53 4.1. Ölükol Hastalığı Belirtileri Gösteren Örneklerin Toplanılması ........................................53 4.2. Fungal Örneklerin İzolasyonu ve Saflaştırılması ..............................................................54 4.3. Phomopsis viticola izolatlarının Morfolojik Tanılanması ve Kültürel Özelliklerinin Belirlenmesi ....................................................................................................................55 4.3.1. Koloni Gelişme Hızları ve Piknit Oluşumu....................................................................55 4.3.2. Koloni renkleri................................................................................................................61 4.3.3. Spor Oluşumları..............................................................................................................65 4.4. Fungal İzolatların Moleküler Tanısı..................................................................................65 4.5. Fungal İzolatlarda dsRNA Varlığının Belirlenmesi ..........................................................67 4.6. dsRNA İçeren ve İçermeyen Phomopsis viticola İzolatlarının Biyolojik Yönden Karakterizasyonu ............................................................................................................69 4.6.1. Koloni Renkleri ..............................................................................................................69 4.6.2. Miselyal Gelişme Hızı....................................................................................................71 4.6.3. Piknit Oluşumu...............................................................................................................75 4.7. dsRNA Pozitif İzolatların Dikey Taşınma Kapasitesinin Ölçülmesi ................................78 4.8. dsRNA içeren Phomopsis viticola İzolatlarının Virülenslik Belirleme Çalışmaları .........79 4.9. dsRNA Pozitif İzolatlarda dsRNA’nın Yatay Taşınma Kapasitesinin Ölçülmesi ............83 4.9.1. İzolatların Vejetatif Uyum (vc) Tiplerinin Belirlenmesi................................................83 4.9.2. dsRNA Yatay Taşınım Çalışmaları................................................................................85 4.10. dsRNA Virüslerinin Hipovirulenslik Üzerine Etkisi (2. Aşama Virülenslik Testleri)....88 4.11. Moleküler Karakterizasyon ve DNA Dizi Okumaları.....................................................93 4.12. İllimuna Sonuçlarına göre dsRNA’nın Biyoinformatik Analizleri .................................98 4.12.1. Ilimuna Okumalarından Kontig Oluşumu ve Self-mapping analizleri.........................99 vi 4.12.2. Genom anotasyonu .....................................................................................................103 4.12.3. BLAST Analizleri ve Filogenetik Ağaç .....................................................................105 5. TARTIŞMA........................................................................................................................113 5.1. Ege Bölgesi Bağ Alanlarından İzole Edilen Phomopsis spp İzolatlarının Kültürel Özelliklerinin Değerlendirilmesi ile Morfolojik ve Moleküler Yöntemler ile Tanılanması...................................................................................................................113 5.2. dsRNA İçeren P. viticola İzolatlarından dsRNA’ların İzole Edilmesi ve Biyolojik Karakterizasyonu ..........................................................................................................117 5.3. Phomopsis viticola’dan İzole Edilen dsRNA’ların Genom Dizilenmesi ve Biyoinformatik Analizleri.............................................................................................129 6. SONUÇ VE ÖNERİLER ...................................................................................................139 KAYNAKLAR.......................................................................................................................143 EKLER ...................................................................................................................................163 Ek 1. Phomopsis spp. izolatların α sporları ölçümünün sayısal verileri ................................163 Ek 2. Fungal izolatların β sporları ölçümünün sayısal verileri ..............................................164 Ek 3. dsRNA pozitif 12 Phomopsis viticola izolatlarının biyolojik ve kültürel özellikleri ...165 Ek 4. 961M den virüs genomun dışında saptanan fungal kontingler.....................................166 Ek 5. 962M den virüs genomun dışında saptanan fungal kontingler.....................................167 BİLİMSEL ETİK BEYANI....................................................................................................169 ÖZ GEÇMİŞ...........................................................................................................................17