KEMOTERAPİ AJANI DOKSORUBİSİN’İN ESCHERICHIA COLI ÜZERİNDEKİ ETKİSİ VE DİRENÇLE İLGİLİ GENLERİN GENOM BOYU KÜTÜPHANE ZENGİNLEŞTİRME VE TARAMA ÇALIŞMALARI İLE ARAŞTIRILMASI

Abstract

ÖZET KEMOTERAPİ AJANI DOKSORUBİSİN’İN Escherichia coli ÜZERİNDEKİ ETKİSİ VE DİRENÇLE İLGİLİ GENLERİN GENOM BOYU KÜTÜPHANE VE TARAMA ÇALIŞMALARI İLE ARAŞTIRILMASI CURNA A.A. 2020, Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Programı Yüksek Lisans Tezi, Aydın, 2020 Kanser hastalıklarının tedavisinde kullanılan kemoterapik ilaçlara karşı, kanser hücreleri zaman zaman direnç gösterebilmektedir. Kanser hücresi, bazı genlerin yapısını ve ifadesini değiştirerek ilaçtan kaçabilmekte ve kanserin nüksetmesi ile ölümcül sonuçlar görülebilmektedir. Direncin moleküler mekanizmasında görevli olabilecek genler ve proteinlerin tespiti, hem temel bilimler açısından, hem de tedavi açılımları sunması bakımından önemlidir. Doksorubisin, kanser tedavisinde rutin olarak kullanılan, aynı zamanda da antibakteriyel etkiye sahip, yaygın bir kemoterapik ajandır. Bu ilaç bir hücreye verildiği zaman, DNA’ya hasar vermekte ve hücrenin ölümüne neden olmaktadır. Ancak, bu ilaca karşı da kanser hücresinin direnç geliştirebildiğine dair raporlar mevcuttur. İlacın hem moleküler hedeflerinin bulunması, hem de direnç gelişiminde doğrudan veya dolaylı olarak rolü olan genlerin tespit edilmesi farklı hücresel sistemlerde araştırılmalıdır. Bu tez çalışmasının amacı, bakteri hücresini model olarak kullanarak, artan doksorubisin konsantrasyonlarında, 4123 genin taranarak, hücreye direnç kazandıran gen adaylarının araştırılmasıdır. Burada, Escherichia coli genlerinin bir ekspresyon plazmidine klonlanması ile elde edilen ASKA klon seti kullanılmıştır. 57 adet mikroplakadan oluşan bu set, 4123 adet gen ile ilaç ilişkisini farklı açıdan irdelememizi sağlayan eşsiz bir genomik kaynaktır. Her bir genin ifadesi IPTG ile indüklenebildiği için, genler taranabilmekte ve yabanıl tipin öldüğü ilaç konsantrasyonunda yaşayan klonun içerdiği gen, direnç fenomeni ile doğrudan veya dolaylı olarak ilişkili olduğu yaklaşımı esas alınmaktadır. Bu çalışmada, ilk olarak, birkaç farklı E. coli yabanıl tip bakteri suşları ile yapılan ön deneylerde, doksorubisinin hangi E. coli suşunu, hangi konsantrasyonda öldürdüğü, minimum inhibe edici konsantrasyon (MIC) deneyleri, büyüme eğrisi deneyleri, spot testleri ve disk difüzyon yöntemleri ile belirlenmiştir. Daha sonra, 4123 adet klonun “genom boyu plazmid xiv kütüphanesi” stokları kullanılarak, ısı şoku yöntemi ile E. coli D10Hb suşuna transforme edilmiştir. Optimizasyon deneylerinden elde edilen konsantrasyon verileri kullanılarak, göreceli olarak yüksek doksorubisin içeren ortamlarda yaşayabilen klonların tespit edilmesi amacıyla, gradient ekim, direkt ekim ve zenginleştirme ile seleksiyon deneyleri gerçekleştirilmiştir. Doksorubisin toleransına sahip, 129 adet koloni ile onaylama çalışmaları yapılmıştır. Daha sonra göreceli olarak en yüksek tolerans değerine sahip 34 koloni seçilmiştir. Seçilen rekombinant plazmidlerin içerdikleri gen dizileri, sanger sekanslama analizi ile belirlenmiştir. Elde edilen sekanslar kullanılarak, Blast analizleri ile gen bilgileri bulunmuştur. Çalışmalar sonucunda, göreceli olarak yüksek doksorubisin konsantrasyonlarında yaşayan E. coli klonlarının plazmidlerinde yer alan genlerin recA (n=23 klon) ve mdtK (n=11 klon) olduğu tespit edilmiştir. Bu genlerin DNA hasarı onarımında ve Na+ kanallarını kullanarak ilacı hücrenin dışına atabilmede görevli olabileceği tartışılmıştır. Ayrıca bu genlerin insan genomunda homologları araştırılmıştır. Bu çalışma, binlerce genin (n=4123) bir ilaçla ilişkisini tarayan ve bakteriyel model hücre yaklaşımı ile kanser konusuna farklı bir açıdan yaklaşan, moleküler biyoloji, mikrobiyoloji ve genomik disiplinlerini kullanan, kapsamlı, orijinal ve yol gösterici sonuçlar veren bir tez çalışmasıdır.İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY SAYFASI ................................................................................................. iii TEŞEKKÜR .............................................................................................................................. iv İÇİNDEKİLER ........................................................................................................................... v SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ............................................................................ viii ŞEKİLLER DİZİNİ ................................................................................................................... ix TABLOLAR DİZİNİ ................................................................................................................ xii ÖZET ....................................................................................................................................... xiii ABSTRACT ............................................................................................................................. xv 1. GİRİŞ ...................................................................................................................................... 1 2. GENEL BİLGİLER ................................................................................................................ 3 2.1. Kemoterapi ve Kemoterapik ajanlar .................................................................................... 3 2.2. Sitotoksik Kemoterapotik ajanlar ........................................................................................ 4 2.3. Sitotoksik Kemoterapotik ajanlardan; Antrasiklinler .......................................................... 5 2.4. Doksorubisin ........................................................................................................................ 7 2.5. Kemoterapotik ajanların geliştirilmesi ile kanser ................................................................ 8 2.6. Doksorubisin ile Tedavilere Yaklaşım ................................................................................ 9 2.7. Doksorubisin Direnci ile İlişki Mekanizmalar .................................................................. 10 2.8. Kanser Etki Mekanizmalarının Belirlenmesinde Moleküler Tekniklerin Kullanılması .... 11 2.9. ASKA (A Complete Set of E. coli K-12 ORF Archive) ................................................... 12 3. GEREÇ VE YÖNTEM ......................................................................................................... 14 3.1. GEREÇLER ...................................................................................................................... 14 3.1.1. ASKA Klon Seti ............................................................................................................. 14 3.1.2. Kullanılan Plazmid ......................................................................................................... 15 3.1.3. Kullanılan İlaç ................................................................................................................ 15 3.2. YÖNTEM .......................................................................................................................... 16 3.2.1. Çalışmada Kullanılması Planlanan Doksorubisin Konstrasyonunun Belirlenmesi ........ 16 3.2.1.1. MIC Yöntemi ............................................................................................................... 16 3.2.1.2. Büyüme Eğrisi ............................................................................................................. 17 3.2.1.3. Disk Difüzyon Yöntemi İle Doksorubisin Direnç Seviyelerinin Belirlenmesi ........... 17 3.2.1.4. Spot Testi ile Doksorubisin Direnç Seviyelerinin Belirlenmesi .................................. 18 3.2.2. DH10b(pCA24N) suşunun eldesi ................................................................................... 18 3.2.2.1. Kompetant DH10b Suşlarının Eldesi .......................................................................... 19 vi 3.2.2.2. Isı Şoku (Heat Shock) İle Transformasyon ................................................................. 19 3.2.2.3. Stok Alınması .............................................................................................................. 20 3.2.3 Doksorubisin Seleksiyonu İçin Kullanılan Teknikler ..................................................... 20 3.2.3.1. Gradient Yöntemi ........................................................................................................ 20 3.2.3.2. Direkt Ekim Yöntemi .................................................................................................. 21 3.2.3.3. Zenginleştirme Yöntemi .............................................................................................. 21 3.2.3.4. Çizgi Ekim Yöntemi .................................................................................................... 23 3.2.3.5. Tek Koloni Ekim Yöntemi .......................................................................................... 24 3.2.4.Tolerant Kolonilerin Plazmidlerindeki Gen Bilgilerinin Tespit Edilmesi ...................... 25 3.2.4.1. Plazmid İzolasyonu ..................................................................................................... 25 3.2.4.2. İzolasyon Örneklerinin Agaroz Jel Elektroforezinde Yürütülmesi ............................ 26 3.2.4.3. Sekansa Gönderilmesi ................................................................................................. 26 3.2.5. Sekans Sonuçlarının Değerlendirilmesi ve Blast............................................................ 26 4. BULGULAR ........................................................................................................................ 28 4.1. Optimizasyon Çalışmaları: Doksorubisin Konsantrasyonlarının Belirlenmesi İçin Yapılan Çalışma Sonuçları ..................................................................................................................... 28 4.1.1. MIC Yöntemi Sonuçları ................................................................................................. 28 4.1.2. Büyüme Eğrisi İle Yapılan Çalışma Sonuçları ............................................................... 30 4.1.3. Spot Test İle Doksorubisin Direnç Seviyelerinin ve Uygun Suşun Belirlenmesi .......... 34 4.1.4. Disk Difüzyon Yöntemi İle Konsantrasyon Belirlemesi ................................................ 35 4.1.5. Kullanılacak Suş ve Doksorubisin Konsantrasyonunun Belirlenmesi ........................... 38 4.2. DH10b- ASKA Havuzunun Elde Edilmesi (DH10b-ASKA Pooled) ............................... 38 4.3. Doksorubisin ile Seleksiyon Çalışmaları ........................................................................... 40 4.3.1. Gradient Yöntemi ile Tespit Edilen Tolerant Koloniler ................................................. 40 4.3.2. Direkt Ekim Yöntemi ile Tespit Edilen Tolerant ........................................................ 44 4.3.3. Zenginleştirme (Enrichment) Yöntemi ile Seleksiyon ................................................... 48 4.3.4. Çizgi Ekim Yöntemi ile Hipertolerantların Seçilmesi .................................................... 54 4.3.5.Seçilen Hipertolerant Kolonilerin Tek Koloni Yöntemi ile Çoğaltılması ve Saflaştırılması ........................................................................................................................... 57 4.4. Hipertolerant Klonların İçerdiği Rekombinant Plazmidlerin Eldesi ................................. 58 4.5. Rekombinant Plazmidlerdeki Insert Sekanslarının Belirlenmesi ve Bazı Biyoinformatik Analizler ................................................................................................................................... 59 5. TARTIŞMA .......................................................................................................................... 60 5.1. recA, DNA rekombinasyon ve tamir mekanizması ........................................................... 61 vii 5.2. mdtK, multidrug efflux pump MdtK ................................................................................ 64 KAYNAKLAR ......................................................................................................................... 69 EKLER ..................................................................................................................................... 85 ÖZGEÇMİŞ .............................................................................................................................. 9