COMPARATIVE INVESTIGATION OF THE EFFICIENCY OF DEXRAZOXANE AND SILYMARIN IN RATS WITH DOXORUBICIN-INDUCED CARDIOTOXICITY

Abstract

Antrasiklinler (ANT) grubunda yer alan Doksorubisin (DOKS), pek çok kansere karşı oldukça etkili olmasına rağmen, diğer kanser ilaçları gibi çok sayıda yan etkileri bulunmaktadır. Bu yan etkiler arasında hayatı tehdit etmesi bakımından en önemlisi kardiyotoksik yan etkidir. DOKS’un kardiyotoksik etkilerinin önlenmesi ya da azaltılmasında kullanılan Deksrazoksan (DEKS)’in tıpkı DOKS gibi Topoizomeraz (Top) II enziminin katalitik inhibitörü olması olması nedeniyle, bu ilaçların birlikte kullanılması durumunda DOKS’un kanser hücreleri üzerindeki etkilerinin azalabileceği endişesine neden olmuştur. Bu bakımdan, DOKS kardiyotoksisitesine karşı kalbi koruyucu etkileri olan ancak TopII enziminin aktivitesi üzerinde etkisi olmayan yeni ajanlara ihtiyaç duyulduğu açıktır. Bu nedenle bu çalışmada antioksidan özelliklere sahip Silimarin (SİL)’in DOKS kardiyotoksisitesine karşı kalbi koruyucu etkileri DEKS ile karşılaştırmalı olarak araştırıldı. Ayrıca, SİL’in kalbi koruyucu etkisinde TopIIβ enziminin rolü değerlendirildi. Bu amaçla, 45 adet 6-8 haftalık Balb/c ırkı fare rastgele seçilerek 6 gruba ayrıldı. Grup I (Kontrol grubu, n=5): Bu gruptaki hayvanlara toplamda 6 hafta süren deneyin ilk 2 ve son 2 haftasında haftada iki doz olmak üzere intraperitoneal (ip) yolla serum fizyolojik (SF) uygulandı. Ayrıca, deney süresi boyunca hergün gavajla SF uygulandı. Grup II (DOKS grubu, n=10): Bu gruptaki hayvanlara deneyin ilk 2 ve son 2 haftasında haftada iki doz olmak üzere ip yolla 3 mg/kg dozda DOKS uygulandı. Grup III (DEKS grubu, n= 5): Bu gruptaki hayvanlara deneyin ilk 2 ve son 2 haftasında haftada iki doz olmak üzere ip yolla 30 mg/kg dozda DEKS uygulandı. Grup IV (DOKS+DEKS grubu, n= 10): Bu gruptaki hayvanlara deneyin ilk 2 ve son 2 haftasında haftada iki doz olmak üzere ip yolla 3 mg/kg dozda DOKS uygulanmasına ilaveten DOKS uygulamalarından 30 dakika önce intraperitoneal yolla 30 mg/kg dozda DEKS uygulandı. Grup V (SİL grubu, n=5): Bu gruptaki hayvanlara 6 hafta boyunca hergün gavajla 100 mg/kg dozda SİL uygulandı. Grup VI (DOKS+SİL grubu, n=10): Bu gruptaki hayvanlara deneyin ilk 2 ve son 2 haftasında haftada iki doz olmak üzere ip yolla 3 mg/kg dozda DOKS uygulanmasına ilaveten deney süresi boyunca hergün gavajla 100 mg/kg dozda SİL uygulandı. DOKS grubunda kalp dokusunda karşılaşılan en belirgin histopatolojik değişiklikler; kardiyomiyositlerde sitoplazmik vakuolizasyon, hiyalin nekrozu ve miyositolizis şeklindeydi. Miyokardiyumda diffuz dağılım gösteren bu değişikliklere çoğunlukla sol ventrikulus duvarı ve interventriküler septumda rastlandı. DEKS ve SİL uygulamalarının kalp dokusunda karşılaşılan histopatolojik değişikliklerin hem yaygınlığını hem de şiddetini belirgin olarak azalttığı saptandı. TnT ve TnI birincil antikorları ile boyanan kalp kesitleri değerlendirildiğinde; DOKS grubunda hem TnI hem de TnT immunoreaktivisinin oldukça azaldığı ortaya kondu (p˂0,001). DEKS ve SİL uygulamalarının Tn kayıplarını belirgin olarak azalttığı dikkati çekti (p˂0,001). DNA hasarını gösteren γH2Ax ifadesi değerlendirildiğinde; DOKS grubunda kardiyak hücrelerin tamamına yakınında yoğun γH2Ax ifadesi saptandı (p˂0,001). DEKS ve SİL uygulamalarının γH2Ax ifadesini belirgin olarak azalttığı ortaya kondu (p˂0,001). Deney grupları TopIIβ enzim düzeyi bakımından karşılaştırıldığında; DEKS ve SİL uygulamalarının kalp dokusu örneklerinde TopIIβ enzim düzeyini belirgin olarak azalttığı görüldü. Bununla birlikte, DEKS grubunda TopIIβ enzim düzeyi SİL grubuna göre daha az idi. Bu sonuçlar, SİL’in kardiyak hücrelerde TopIIβ enziminin ifadesini azaltarak DOKS kardiyotoksisitesine karşı koruyucu etki gösterdiğini düşündürdü.KABUL ve ONAY SAYFASI………………………………………………………….. i TEŞEKKÜR……………………………………………………………………………. ii İÇİNDEKİLER………………………………………………………………………… iii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ…………………………………………… vi ŞEKİLLER DİZİNİ……………………………………………………………………. vii RESİMLER DİZİNİ…………………………………………………………………… x TABLOLAR DİZİNİ…………………………………………………………………... xii ÖZET……………………………………………………………………………..…… xiii ABSTRACT……………………………………………………………………………. xv 1. GİRİŞ……………………………………………………………………….… 1 2. GENEL BİLGİLER……………………………………………………..…….. 3 2.1. ANT Kardiyotoksisitesinde Kalp Dokusunda Karşılaşılan Histopatolojik Değişiklikler…………………………………………………………..……..... 4 2.2. ANT Kardiyotoksisitesinden Sorumlu Mekanizmalar……………………...... 5 2.2.1. ANT Kardiyotoksisitesinde Serbest Radikallerin Rolü……………………… 6 2.2.2. ANT Kardiyotoksisitesinde Demir İyonunun Rolü…………………….…..... 8 2.2.3. ANT Kardiyotoksisitesinde Topoizomeraz Enziminin Rolü…………….…... 9 2.2.3.1. Topoizomeraz enziminin yapısı ve izoformları……………………………… 10 2.2.3.2. Topoizomeraz enziminin katalitik döngüsü………………………………...... 12 2.2.3.3. Çift zincir kırıkları…………………………………………………………… 13 2.2.3.4. Histon proteinleri…………………………………………………………….. 15 2.3. Silimarin……………………………………………………………………... 17 2.3.1. Deve Dikeni Bitkisinin Özellikleri…………………………………………... 17 2.3.2. Silimarinin Kimyasal Yapısı ve Farmakolojik Özellikleri…………………... 18 2.3.3. Silimarinin Kalp Hastalıklarına Karşı Koruyucu Etkileri…………………… 18 2.4. Kalp Kasının Kasılmasında Görevli Proteinler……………………………… 22 2.4.1. Aktin ve Miyozin İplikçiklerinin Moleküler Yapısı…………………………. 23 2.4.2. Kalp Kasının Kasılma Mekanizması………………………………………… 24 2.4.3. Troponinler…………………………………………………………………... 24 2.4.3.1. Troponin C…………………………………………………………………… 25 2.4.3.2. Troponin I……………………………………………………………………. 25 2.4.3.3. Troponin T…………………………………………………………………… 26 2.4.4. ANT’nin Kardiyotoksik Etkilerinin Saptanmasında Troponinlerin Kullanımı…………………………………………………………………….. 28 3. GEREÇ VE YÖNTEM………………………………………………………. 31 3.1. Deney Hayvanları…………………………………………………………..... 31 3.2. Deney Tasarımı……………………………………………………………… 31 3.3. Nekropsi ve Histopatolojik İnceleme………………………………………... 33 3.4. İmmunohistokimyasal İnceleme……………………………………………... 34 3.5. İmmunohistokimyasal Boyama Sonuçlarının Değerlendirilmesi……………. 35 3.6. İmmunoblotlama (Western blotting)………………………………………… 36 3.6.1. Dokuların Homojenizasyonu, Total Protein İzolasyonu ve Protein Miktarının Belirlenmesi………………………………………………………………….. 38 3.6.2. SDS-PAGE Jelinin Hazırlanması ve Elektroforezis İşlemi………………...... 39 3.6.3. Ayrıştırılan Proteinlerin PVDF Membrana Transferi………………………... 40 3.6.4. Antikor ile İnkübasyon………………………………………………………. 40 3.6.5. Görüntüleme ve Analiz………………………………………………………. 41 3.7. Kantitatif Eş Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu………………………… 41 3.7.1. RNA İzolasyonu……………………………………………………………... 43 3.7.2. RNA Kalite Kontrolü………………………………………………………... 43 3.7.3. Komplementer DNA Sentezi………………………………………………… 44 3.7.4. Polimeraz Zincir Reaksiyonu………………………………………………... 44 3.8. İstatistiksel Analiz…………………………………………………………… 45 4. BULGULAR…………………………………………………….………….... 46 4.1. Haftalara Göre Canlı Ağırlık Değişimleri…………………………………… 46 4.2. Makroskobik Bulgular……………………………………………………….. 47 4.3. Histopatolojik Bulgular……………………………………………………… 47 4.4. İmmunohistokimyasal Bulgular……………………………………………... 50 4.4.1. Kalp Dokusunda Troponin T İmmunoreaktivitesi…………………………... 50 4.4.2. Kalp Dokusunda Troponin I İmmunoreaktivitesi……………………………. 52 4.4.3. Kalp Dokusunda γH2Ax İmmunoreaktivitesi………………………………... 55 4.4.4. Kalp Dokusunda TopIIβ İmmunoreaktivitesi………………………………... 56 4.5. İmmunoblotlama Sonuçları………………………………………………….. 58 4.5.1. Kalp Dokusu Örneklerinde Troponin I İfade Düzeyi………………………... 59 4.5.2 Kalp Dokusu Örneklerinde Troponin T İfade Düzeyi……………………….. 61 4.5.3. Kalp Dokusu Örneklerinde γH2Ax İfade Düzeyi……………….…………..... 64 4.6. Kantitatif Eş Zamanlı PCR Sonuçları………………………………………... 65 4.6.1. TopIIβ Geninin Amplifikasyon Verimliliği..……………………….................. 67 4.6.2. β-aktin Geninin Amplifikasyon Verimliliği.………………………................... 69 4.6.3. Kalp Dokusu Örneklerinde TopIIβ Enziminin Gen İfade Düzeyi…………… 70 5. TARTIŞMA………………………………………………………………….. 72 6. SONUÇ VE ÖNERİLER……………………………………………………. 77 KAYNAKLAR………………………………………………...………………………. 79 ÖZGEÇMİŞ…………………………...……………………………………………….. 9