Modification of Flavobacterium johnsoniae genome to investigate the functions of alternative complex III ActD and ActE subunits

Abstract

Alternatywny kompleks III (ACIII) występujący w błonie niektórych bakterii stanowi kluczowy element łańcucha oddechowego. Pełni taką samą rolę jak kompleks III w błonie mitochondrialnej, którego zadaniem jest utlenienie chinolu. W mitochondriach reakcji tej towarzyszy translokacja protonów przez błonę. W ten sposób powstaje gradient protonów, który jest jednym ze składowych siły protonomotorycznej, potrzebnej do produkcji uniwersalnego nośnika energii - ATP, wykorzystywanego do wielu procesów zachodzących w komórce. Mimo tej samej funkcji, ACIII posiada całkowicie odmienną strukturę niż mitochondrialny kompleks III. Dwie podjednostki kompleksu, ActA oraz ActE, zawierają hemy typu c, które umożliwiają transfer elektronu poprzez procesy utlenienia oraz redukcji (reakcje redoks). Podjednostka ActA przenosi elektron na cytochrom aa3, pełniący funkcję terminalnej oksydazy, która redukuje cząsteczkę tlenu. Z kolei podjednostka ActE nie jest kluczowa dla tego transferu i prawdopodobnie jest częścią alternatywnego szlaku elektronowego, który wpływa na bardziej wydajny wzrost bakterii. Pierwszym celem tej pracy była izolacja kompleksu ACIII z dodaną metką białkową i znalezienie potencjalnych partnerów oddziałujących z podjednostką ActE. Z użyciem tradycyjnego klonowania molekularnego, skonstruowano plazmid z którego zachodzi ekspresja genu kodującego białko ActD z genetycznie dodaną metką Strep-tag. Następnie przeniesiono plazmid do szczepu F. johnsoniae, aby oczyścić kompleks ACIII z użyciem chromatografii powinowactwa. Kolejnym podejściem do zrealizowania tego celu była konstrukcja mutanta z delecją podjednostki ActD z użyciem metody rekombinacji homologicznej. Następnie szczep skomplementowano tym samym plazmidem i podjęto próbę izolacji kompleksu. Drugim celem pracy było określenie, czy podjednostka ActD jest kluczowa dla złożenia się kompleksu i wbudowania go w błonę. Wykonano to poprzez izolację błon ze szczepów z delecją oraz komplementacją genu actD i sprawdzenie obecności poszczególnych podjednostek kompleksu. Porównano także szybkość wzrostu mutantów z delecją i komplementacją ze szczepem dzikim. Wyniki pracy nie pozwoliły na identyfikację białek oddziałujących z ACIII z powodu uzyskania niewielkiej ilości kompleksu, ale są wskazaniem do innego rozwiązania, aby wyizolować kompleks zastosowaną metodą. Ponadto udowodniono, że podjednostka ActD nie jest kluczowa dla wbudowania się kompleksu w błonę, ale jej brak obniża szybkość wzrostu bakterii. Wyniki przeprowadzonych badań mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia działania alternatywnego kompleksu III u F. johnsoniae.Alternative complex III (ACIII) localized in the membrane of some bacterial species is the key element of respiratory chain. It performs the same function as typical complex III in mitochondrial membranes, which is the electron transfer from the quinol pool to the complex IV (terminal oxidase). In mitochondria this reaction is coupled with the proton translocation through the membrane. This way the proton gradient is formed, which is the component of protonmotive force needed for the ATP synthesis. ATP is the universal energy carrier utilized to drive many processes in the cell. Despite the same function, ACIII is structurally different from mitochondrial complex III. Two ACIII subunits – ActA and ActE contain type c hemes, which allow the transfer of electron through the oxidation and reduction of the cofactors (redox reactions). ActA transfers the electron to the cytochrome aa3, which performs the role of terminal oxidase and reduce the oxygen molecule. In turn, ActE subunit is not essential for this transfer and most probably is the part of the alternative electron pathway for quinol pool oxidation, which is beneficial for bacterial growth. First aim of this work was to isolate ACIII with genetically-added protein tag and identification of potential redox partners interacting with ActE. By using traditional cloning techniques the plasmid was constructed, from which the expression of actD gene with the genetically added protein tag occurs. The plasmid was transferred to the F. johnsoniae strain to purify the complex using affinity chromatography. Another approach to achieve this aim was to construct a deletion mutant lacking ActD subunit using the homologous recombination. The obtained strain was complemented with the same plasmid and the trial to isolate the complex was made. The second aim was to assess if ActD subunit is necessary for the complex assembly in the membrane. It was done by isolation of the membranes from deletion and complementation strains, and verification of the individual complex subunits presence. Also, the comparison of growth rates of the obtained strains was performed. Results of this work did not allow to identify proteins interacting with ACIII because of the low amount of the obtained complex, however they are an indication for another solution to the complex isolation with this method. Moreover, it was proven that ActD subunit is not essential for the complex assembly in the membrane, however its absence slows down the bacterial growth. Results of this work may contribute to the better understanding of ACIII activity in F. johnsoniae