Those of you who have heard me giving a talk about CRISPR, or have read my book “Editing genes: cut, paste and color. The wonderful CRISPR tools” (NextDoor Publishers, 2019) will already know that one of the phrases I repeat most is: “the imagination is the limit of CRISPR applications”. That is why we should not be surprised that the CRISPR universe also has something to say in the current global health crisis caused by the SARS-CoV-2 coronavirus, which causes COVID-19. In this article I will explain the two main groups of CRISPR applications to DIAGNOSE and to FIGHT the coronavirus.Los que me hayáis escuchado alguna vez impar- tiendo una charla sobre CRISPR, o hayáis leído mi libro «Editando genes: recorta, pega y colorea. Las maravillosas herramientas CRISPR» (NextDoor Pu- blishers, 2019) ya sabréis que una de las frases que más repito yo es: «la imaginación es el límite de las aplicaciones CRISPR». Por eso no nos debería sorprender que el universo CRISPR también tenga algo que decir en la crisis actual sanitaria mundial causada por el coronavirus SARS-CoV-2, causante de la COVID-19. En este artículo explicaré los dos grandes grupos de aplicaciones CRISPR para DIAG- NOSTICAR y para COMBATIR el coronavirus

Montoliu, Lluís

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VOL.XII. . . No.170 ENCUENTROS EN LA BIOLOGÍA 16CRISPR y coronavirusDr. Lluís Montoliu.Artículo publicado en el blog NAUKAS el 3 de abril de 2020¿Que pueden aportar las herramientas de edición genética CRISPR en la investigación para detectar y derrotar al coronavirusSARS-CoV-2 causante de la COVID-19? Fotografía: Lluís MontoliuLos que me hayáis escuchado alguna vez impar-tiendo una charla sobre CRISPR, o hayáis leído milibro «Editando genes: recorta, pega y colorea. Lasmaravillosas herramientas CRISPR» (NextDoor Pu-blishers, 2019) ya sabréis que una de las frases quemás repito yo es: «la imaginación es el límite delas aplicaciones CRISPR». Por eso no nos deberíasorprender que el universo CRISPR también tengaalgo que decir en la crisis actual sanitaria mundialcausada por el coronavirus SARS-CoV-2, causantede la COVID-19. En este artículo explicaré los dosgrandes grupos de aplicaciones CRISPR para DIAG-NOSTICAR y para COMBATIR el coronavirus.Diagnóstico del coronavirus me-diante CRISPRLa primera «aplicación» CRISPR para elnuevo coronavirus vino de la mano del laboratoriode Feng Zhang (BROAD-MIT, Boston, MS, USA),el inventor de la técnica de diagnóstico medianteCRISPR llamada SHERLOCK (nombre con evidentegancho y doble sentido, que es un acrónimo de laspalabras en inglés Specific High-sensitivity EnzymaticReporter unLOCKing), y que su laboratorio descri-bió en 2017. El diagnóstico mediante CRISPR y latécnica SHERLOCK está ilustrado en la figura queencabeza este artículo. Esencialmente el protocolose basa en una nueva proteína efectora Cas, que yano es Cas9 sino que es Cas13a, de otra bacteria. LaCas13a tiene la capacidad de cortar ARN (y no ADN,como Cas9), y de activarse gracias a una pequeñaguía de ARN específica que sea complementaria alARN que se quiere cortar y degradar. El grupo deFeng Zhang encontró que al activarse in vitro (en ellaboratorio) esta RNAsa (nucleasa que degrada elARN) esta parecía volverse loca y acababa cortandoy degradando no solamente el ARN complementariodiana sino todos los ARN que hubiera en el ensayo1.Este hallazgo, que hubiera sido interpretado como ungran fiasco por la mayoría de investigadores, despertóla perspicacia y el talento de Feng Zhang, y acabóconvirtiendo un resultado negativo inesperado en unanueva aplicación para diagnosticar la presencia demoléculas de ADN (y ARN) presentes en ínfimascantidades en una muestra2.La idea magistral que se oculta tras SHER-LOCLK es la adición de unas pequeñas molé-culas de ARN (de color morado en la ilustraciónde cabecera) que tienen en uno de sus extremos unamoléculas fluorescente (F) y en el otro extremo unamolécula inhibidora de esa fluorescencia (N). Cuandolas dos moléculas F y N están juntas no se emitefluorescencia. Tras activarse el corte del ARN dia-na por parte de la proteína Cas13a, gracias a unaguía específica de ARN, complementaria al ARN adetectar, la Cas13a no solo corta ese ARN sino todoslos presentes en la mezcla, incluyendo las pequeñasmoléculas de ARN de color morado. Estas, al par-tirse, liberarán las moléculas F y N por separado y,1J.S. Gootenberg y otros. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 356(6336):438-442, 2017. doi:10.1126/science.aam93212M. J. Kellner y otros. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nature protocols, 14, 2986–3012, 2019.VOL.XII. . . No.170 ENCUENTROS EN LA BIOLOGÍA 17entonces, la molécula F podrá brillar y mostrar sufluorescencia, siendo posible detectar este brillo deluz mediante detectores lumínicos específicos. Dadoque la fluorescencia no aparece hasta que se iniciela degradación de los ARN y, dado que esta degra-dación no se inicia si no es en presencia del ARNcomplementario a la guía ARN específica, el siste-ma SHERLOCK representa un método muyespecífico y sensible (se estima su sensibilidad enel orden de attomolar, esto es detecta una moléculade ARN que esté diluida hasta una concentración de10−18 molar) para detectar un ADN (que debe serconvertido primero a ARN mediante una transcrip-ción in vitro) o un ARN (que no necesita ese primerpaso y puede aplicarse directamente).Efectivamente, a principios de este año, y tras co-nocerse la secuencia del genoma ARN del coronavirusSARS-CoV-2, causante de la COVID-19, el labora-torio de Feng Zhang hizo público un protocolode detección del coronavirus mediante SHER-LOCK y compartió el protocolo y los detalles técni-cos para llevarlo a cabo en una publicación abierta atodo el mundo. El protocolo es relativamente sencillo(si se tienen todos los reactivos, fácilmente obteniblesdesde Addgene y otros proveedores) y puede com-pletarse en apenas 1 hora. La sensibilidad delmétodo permite detectar hasta 10-100 molécu-las del genoma del coronavirus por microlitro( 20-200 aM) Como ellos mismos indican en su proto-colo de detección, este no está todavía homologado niautorizado para aplicarlo en el diagnóstico clínico delcoronavirus (algo que tendrá que aprobar eventual-mente la FDA, tras realizar las revisiones y análisiscorrespondientes), pero si puede usarse de forma ex-perimental, en los laboratorios. La empresa creadapor Zhang «Sherlock Biosciences» está desarrollandoel kit de detección y esperando poder aplicar estatecnología para realizar diagnósticos masivos del co-ronavirus SARS-CoV-2 mediante SHERLOCK.Esquema que ilustra el protocolo de diagnóstico de ADN mediante CRISPR-Cas13a, diseñado por el equipo de FengZhang (BROAD-MIT, EE UU) y denominado SHERLOCK. El mismo protocolo puede aplicarse para detectar ARN(p.e. el genoma del coronavirus SARS-CoV-2) simplemente saltándose el primer paso. Esquema realizado por LluísMontoliu. Esta figura aparece ilustrando uno de los capítulos del libro «Editando genes: recorta, pega y colorea. Lasmaravillosas herramientas CRISPR», Lluís Montoliu, NextDoor Publishers 2019.VOL.XII. . . No.170 ENCUENTROS EN LA BIOLOGÍA 18Tras el sistema SHERLOCK aparecieron dos métodos mejorados de diagnóstico genético mediante CRISPR, desarro-llados por los laboratorios de Feng Zhang (SHERLOCKv2) y Jennifer Doudna (DETECTR), como expliqué en unaentrada previa de este blog.A principios de 2018, el laboratorio de Jennifer Doud-na (UC Berkeley, CA, USA), una de las pioneras de larevolución CRISPR y sus aplicaciones en edición gené-tica, desarrolló un test de diagnóstico genético CRISPRanálogo a SHERLOCK pero basado en otra proteína Cascon propiedades similares a Cas13a. En este caso se tra-taba de la proteína Cas12a y al método resultante lobautizaron como DETECTR (nombre también con doblesentido y cuidadosamente elegido, que es un acrónimode las palabras en inglés DNA Endonuclease TargEtedCRISPR Trans Reporter). En paralelo, el laboratorio deFeng Zhang respondió combinando hasta cuatro proteí-nas Cas con actividades RNAsa (Cas13b de dos bacteriasdistintas, Cas13a y Cas12a) para detectar hasta cuatromoléculas de ADN (o ARN) distintas, en un desarrollotecnológico que llamó naturalmente como SHERLOCKv2.En una entrada anterior de este blog comparé y expli-qué en detalle los dos sistemas de diagnóstico basados enCRISPR: DETECTR y SHERLOCK.Naturalmente el sistema DETECTR también puedeaplicarse para detectar el coronavirus SARS-CoV-2. Hanaparecido publicaciones que usan la proteína Cas12a paradiagnosticar la presencia del coronavirus de forma rápida,sencilla y asequible. Alguno de estos métodos que usanla proteína Cas12a es capaz de detectar el virus HIV,causante del SIDA, y el coronavirus SARS-CoV-2, simul-táneamente. La empresa fundada por Jennifer Doudna,Mammoth Biosciences, de igual forma que Sherlock Bios-ciences, también está desarrollando sistemas de deteccióndel coronavirus basados en la tecnología DETECTR, queanuncian que pueden ser todavía más rápidos (20 minutos),simples y programables.De cualquier manera, estos métodos innovadores dediagnóstico de la presencia del genoma ARN del coronavi-rus mediante SHERLOCK o DETECTR representan lapunta de lanza biotecnológica de los diagnósticos genéticosbasados en CRISPR, y seguramente serán la respuestaque necesitamos para poder detectar este virus de formamasiva, rápida y sencilla. Por el momento, en un listado enel que aparecen la mayoría de test de diagnóstico de SARS-CoV-2 comerciales o en desarrollo solo se menciona unkit de diagnóstico, en desarrollo, basado en la tecnologíaCRISPR.VOL.XII. . . No.170 ENCUENTROS EN LA BIOLOGÍA 19Normalmente las herramientas CRISPR de edición genética son capaces de editar ADN. Esta es su aplicación máscomún y se la conoce con el nombre de aplicaciones CRISPR 1.0. Sin embargo algunas variantes de las herramientasCRISPR pueden también editar ARN, y son conocidas como las aplicaciones CRISPR 2.0. La figura representa unejemplo de cada tipo. Esquema realizado por Lluís Montoliu. Esta figura aparece ilustrando uno de los capítulos dellibro «Editando genes: recorta, pega y colorea. Las maravillosas herramientas CRISPR», Lluís Montoliu, NextDoorPublishers 2019.Combatir al coronavirus medianteCRISPRGeneralmente todos tenemos en mente que las herra-mientas CRISPR son capaces de editar cualquier secuenciade ADN. Y esto es cierto. Las variantes más comunmenteutilizadas (CRISPR-Cas9) cortan y promueven la ediciónde ADN. Son las llamadas herramientas CRISPR 1.0.Adicionalmente, como he explicado en el apartado an-terior, existen diversas proteínas Cas con capacidad decortar ARN de forma específica. Algunas de ellas, como laCas13b, han sido modificadas en el laboratorio, eliminan-do su capacidad de corte y combinándolas con actividadesdesaminasas que son capaces de cambiar directamente,químicamente, algún ribonucleótido específico (alguna le-tra concreta del ARN, la A por la G, o la C por la U),permitiendo la edición directa del ARN, lo que se ha veni-do a llamar las herramientas de edición CRISPR 2.0, comoestán ilustradas en la figura anterior. Estas herramientas(de las que existen diversas modalidades ya disponibles)podrían usarse, por ejemplo, para alterar la secuenciadel genoma ARN del coronavirus SARS-CoV-2 mutandoaquellos genes que le confieren la virulencia y, por ello,convirtiéndose en herramientas CRISPR para combatir lainfección del coronavirus.Sin embargo, una forma todavía más efectiva de com-batir al coronavirus SARS-CoV-2 mediante CRISPR esprecisamente usando la capacidad que tienen algunas deestas proteínas Cas13 para cortar, degradar y destruirmoléculas de ARN específicas. En particular usando laproteína Cas13d, con actividad RNAsa específica, guiadapor una pequeña molécula de RNA.En febrero de este año apareció publicado en la revis-ta Cell Research un artículo, lanzado desde la Facultadde Medicina de Harvard, en EE.UU., que postulaba undiseño terapéutico basado en Cas13d para combatirel coronavirus mediante CRISPR. Los autores de lapropuesta habían localizado múltiples dianas para usarcomo complementarias a las guías ARN de la proteínaCas13d en el genoma del coronavirus SARS-CoV-2. Supropuesta incluía introducir dentro de partículas viralesAAV (virus adeno-asociados, muy utilizados en terapiagénica) el gen que codifica la proteína Cas13d y un bloquede expresión de tres guías de ARN que usaría la Cas13dpara cortar el genoma del coronavirus. El AAV recombi-nante resultante podría administrarse por vía aérea, paraque llegará fácilmente a los pulmones, entrara en las cé-lulas cargadas de coronavirus y los destruyera. En teoría.Ahora falta demostrar en la práctica toda esta pro-puesta, de momento lanzada como una propuestainteresante, innovadora, pero teórica, todavía endesarrollo.VOL.XII. . . No.170 ENCUENTROS EN LA BIOLOGÍA 20Uso de la proteína CRISPR-Cas13d incluida dentro de AAV, junto a guías de ARN específicas, para combatir el genomaARN del coronavirus SARS-CoV-2 rompiendo la molécula de ARN del virus en diferentes partes y promoviendo conello su degradación. Figura modificada de la publicación Nguyen et al. Cell Research (2020).Otro estudio, este sí ya completado experimentalmen-te, desarrollado en la costa oeste de EE.UU., en la Univer-sidad de Stanford, acaba de ser depositado en el servidorde pre-prints bioRxiv, el pasado 14 de marzo de 2020,y en él los investigadores también usan la estrategiade Cas13d para combatir a diferentes virus RNA.En este trabajo los autores prepararon una línea de célu-las humanas epiteliales de pulmón a las que previamentetransformaron con una construcción génica para que pro-dujeran constantemente proteína Cas13d y un marcadorfluorescente. Posteriormente estas células las transfectabancon nuevas construcciones capaces de producir las guíasRNA que necesita la proteína Cas13d para cortar el ARNen posiciones específicas y exponían las células o bien aconstrucciones que simulan la infección con el coronavirusSARS-CoV-2 o a virus de la gripe (IAV), que tambiéntiene moléculas de ARN en su genoma. En ambos casostuvieron éxito, consiguiendo una degradación de lassecuencias del ARN del SARS-CoV-2 y una inhi-bición en la replicación del virus de la gripe. Losautores bautizaron su método con el no menos ingeniosonombre de PAC-MAN (acrónimo de las palabras en inglésProphylactic Antiviral CRISPR in huMAN cells). Los au-tores realizaron un análisis comparativo de los genomasde todos los coronavirus humanos conocidos y llegarona encontrar seis moléculas de ARN que pueden actuarcomo guía para la proteína Cas13d, capaces de aparearsecon secuencias comunes a todos los coronavirus conocidosque nos infectan a los seres humanos, lo cual, de poderverificarse, representaría una arma antiviral profilác-tica y terapéutica extraordinariamente vesátil ypoderosa, basada en herramientas CRISPR. Aun-que sabemos poco de las nuevas versiones CRISPR, deestas proteínas Cas13d, ya sabemos que pueden fun-cionar también bien in vivo, en animales. MiguelÁngel Moreno Mateos, investigador Ramón y Cajal de laUniversidad Pablo de Olavide, en el Centro Andaluz deBiología del Desarrollo (CABD) en Sevilla, ha demostrado,en un estudio reciente, depositado en bioRxiv el 14 deenero de 2020, que este sistema CRISPR-Cas13d funcionapara reducir la expresión de genes específicos en embrionesde pez cebra, de pez medaka, de pez killi y de ratón. Unosdatos muy interesantes que permiten albergar esperanzaspara su futuro uso en animales adultos y, eventualmente, sitodos los análisis previos fueran exitosos, en personas. Lasherramientas CRISPR no dejan de sorprendernos. Hanaparecido en los laboratorios, apenas hace siete años, yhan venido para quedarse. Y la imaginación desbordantey sin límites de los investigadores hace el resto. ¡Largavida a las CRISPR! ¡Mucho éxito diagnosticandoy combatiendo a los coronavirus!

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