Obtención de nutrientes y compuestos bioactivos a partir de biomasa marina y evaluación de la toxicidad con bioensayos = Nutrients and bioactive compounds recovery from marine biomass and toxicity evaluation using bioassays

Abstract

Esta Tesis Doctoral se centra en primer lugar en la utilización de la fermentación con bacterias ácido-lácticas aisladas de pescado para la obtención de compuestos antioxidantes y antifúngicos a partir de subproductos de pescado. Se identificaron ácidos fenólicos como el ácido DL-3-fenil-láctico y el ácido benzoico tras fermentar caldos elaborados con carne de pescado y subproductos durante diferentes tratamientos. Los extractos obtenidos de la fermentación de subproductos de pescado por bacterias aisladas del colon y del estómago mostraron la mejor actividad antioxidante. Además, demostraron actividad antifúngica frente a diferentes cepas de hongos de los géneros Penicillium, Aspergillus y Fusarium. Para optimizar la extracción de compuestos bioactivos de subproductos de pescado, se emplearon pulsos eléctricos (PE). Este pretratamiento mejoró la extracción de proteínas y compuestos antioxidantes de la cabeza y la piel del pescado, aunque no mejoró la extracción en el caso de las vísceras. Los PE alteraron la distribución del peso molecular de las proteínas extraídas y de la recuperación de minerales, la cual varió según el subproducto y mineral estudiado. Por otra parte, la exposición de los extractos obtenidos de la cabeza de pescado en cultivos de células SH-SY5Y mostraron un aumento en la viabilidad celular. Además, se estudió el efecto de los PE en la recuperación de compuestos bioactivos de la microalga espirulina (Arthrospira platensis). Se probaron diferentes tiempos de extracción y disolventes, obteniéndose mejores resultados con tiempos de extracción cortos en la extracción de clorofilas, carotenoides y compuestos fenólicos totales en los primeros minutos de extracción. La eficiencia de la extracción con fluidos supercríticos (EFS) en la recuperación de compuestos de la espirulina también fue evaluada. La EFS mejoró la extracción de ficocianina, clorofila, carotenoides y minerales en comparación con la extracción convencional. Además, se observó una mayor recuperación de ácidos grasos específicos. El extracto obtenido con EFS también mostró una mejora en la viabilidad celular cuando se expuso a las células SH-SY5Y. Siguiendo con el estudio de las microalgas, se evaluó cómo la adición de espirulina y chlorella (Chlorella vulgaris), además de diversas legumbres, a productos cárnicos procesados afecta a los parámetros fisicoquímicos y nutricionales. Se observó un cambio significativo en los parámetros de color tras la incorporación de proteínas de microalgas y un aumento del contenido total de aminoácidos con la inclusión de proteínas de espirulina. Finalmente, se estudió la actividad citoprotectora de los extractos obtenidos en cultivos de células SH-SY5Y expuestos a la micotoxina citrinina (CIT). Se evaluaron los efectos citotóxicos de la CIT expuesta de forma individual y combinada con los extractos. Se compararon los resultados en dos modelos in vitro, cultivos de células SH-SY5Y en monocapa (2D) y esferoides (3D) y un modelo in vivo, embriones de pez cebra (Danio rerio). Los resultados demostraron que la CIT afectó el potencial de membrana mitocondrial, indujo apoptosis, detuvo el ciclo celular y causó alteraciones en el retículo endoplásmico en células SH-SY5Y. En el modelo in vivo de embriones de pez cebra, la exposición a altas concentraciones de CIT provocó malformaciones. La exposición combinada de CIT con los extractos optimizados de cabeza de lubina obtenidos mediante PE y extracto etanólico de espirulina, mostró un aumento de la viabilidad celular y una reducción en la apoptosis en comparación con la exposición a CIT sola en células SH-SY5Y.This doctoral thesis focuses first of all on the use of fermentation with lactic acid bacteria isolated from fish to obtain antioxidants and antifungals from fish side streams. Phenolic acids such as DL-3-phenyl-lactic acid and benzoic acid were identified after fermenting broths made with fish meat and side streams during different treatments. The extracts obtained from the fermentation of fish side streams by bacteria isolated from the colon and stomach showed the best antioxidant activity. In addition, they demonstrated antifungal activity against different strains of fungi from the Penicillium, Aspergillus, and Fusarium genera. To optimise the extraction of bioactive compounds from fish side streams, pulsed electric fields (PEF) were used. This pre-treatment improved the extraction of proteins and antioxidant compounds from the head and skin of the fish, although it did not improve extraction in the case of the viscera. The PEF treatment altered the molecular weight distribution of the extracted proteins and the recovery of minerals, which varied according to the by-product and mineral studied. On the other hand, the exposure of extracts obtained from the fish head in SH-SY5Y cell cultures showed an increase in cell viability. In addition, the effect of PEF on the recovery of bioactive compounds from the microalgae spirulina (Arthrospira platensis) was studied. Different extraction times and solvents were tested, with better results obtained with short extraction times in the extraction of chlorophylls, carotenoids, and total phenolic compounds in the first minutes of extraction. The efficiency of extraction with supercritical fluids (SFE) in the recovery of compounds from spirulina was also evaluated. The SFE improved the extraction of phycocyanin, chlorophyll, carotenoids, and minerals compared to conventional extraction. In addition, a higher recovery of specific fatty acids was observed. The extract obtained with SFE also showed an improvement in cell viability when exposed to SH-SY5Y cells. Continuing with the study of microalgae, it was evaluated how the addition of spirulina and chlorella (Chlorella vulgaris), in addition to various legumes, to processed meat products affects the physicochemical and nutritional parameters. A significant change in colour parameters was observed after the incorporation of microalgae proteins and an increase in the total amino acid content with the inclusion of spirulina proteins. Finally, the cytoprotective activity of the extracts obtained in SH-SY5Y cell cultures exposed to the mycotoxin citrinin (CIT) was studied. The cytotoxic effects of CIT exposed individually and combined with the extracts were evaluated. The results were compared in two in vitro models, SH-SY5Y cell cultures in monolayer (2D) and spheroids (3D), and an in vivo model, zebrafish embryos (Danio rerio). The results showed that CIT affected the mitochondrial membrane potential, induced apoptosis, stopped the cell cycle, and caused alterations in the endoplasmic reticulum in SH-SY5Y cells. In the in vivo model of zebrafish embryos, exposure to high concentrations of CIT caused malformations. The combined exposure of CIT with the optimised extracts of sea bass head obtained by PEF and ethanolic extract of spirulina, showed an increase in cell viability and a reduction in apoptosis compared to exposure to CIT alone in SH-SY5Y cells