Mitochondria are involved in numerous cellular processes, including energy production
and cell death regulation. Simultaneously, these are the main cellular producers of reactive
oxygen species (ROS), particularly when dysfunctional. ROS accumulation leads to oxidative
stress which is associated with pathologies, such as stroke and neurodegenerative diseases. So,
elimination of ROS-producing damaged mitochondria is key for maintaining cell homeostasis.
Mitophagy, consists of the selective degradation of excessive or damaged mitochondria. The
accumulation of ROS and mitochondrial depolarization stimulates PTEN-induced kinase 1
(PINK1)/PARKIN-mediated mitophagy. Concomitantly, ROS are counteracted by glutathione, a
key antioxidant. ROS oxidize glutathione and stimulate protein S-glutathionylation, a post-
translation modification capable of modulate protein function. Here, the main goal was to ex-
plore the molecular mechanisms underlying mitophagy, in particular the role of ROS and/or
glutathione signaling in mitophagy progression, with a special focus on protein S-glutathi-
onylation. We hypothesized that mitophagy can be regulated by glutathione signaling, namely
that the accumulation of mitochondrial ROS stimulates the production and oxidation of gluta-
thione, which enhances/stimulates mitophagy by protein glutathionylation of mitophagy-re-
lated proteins. Using human cell lines, SH-SY5Y and SH-SY5Y mitoQC, mitochondrial dysfunc-
tion was stimulated with the classical uncoupler carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone
(CCCP). ROS generation and PINK1/PARKIN-dependent mitophagy were observed after CCCP
treatment. Likewise, the catalytic subunit of the rate limiting enzyme for glutathione synthesis,
Glutamate-Cysteine Ligase, is upregulated in CCCP-treated cells. Notably, we show for the first
time that CCCP treatment induces protein S-glutathionylation of PINK1. Furthermore, we also
found fluorescence measure on a microplate reader to be a possible new technique to assess
mitophagy. Understating mitophagy mechanisms and how these are regulated is key to stimulate cytoprotection by preventing cell death. Thus, this can eventually contribute to new
strategies against diseases characterized by mitochondrial damage, like stroke.As mitocôndrias são essenciais em processos celulares como produção de energia e
regulação da morte celular. Simultaneamente, são as principais produtoras de espécies reativas
de oxigênio (ROS), particularmente quando disfuncionais. A acumulação de ROS leva a stress
oxidativo que está associado a patologias, como acidente vascular cerebral e doenças neuro-
degenerativas. Assim, a eliminação de mitocôndrias danificadas produtoras de ROS é funda-
mental para a homeostase celular. A mitofagia consiste na degradação seletiva de mitocôn-
drias excessivas ou danificadas. Acumulação de ROS e despolarização mitocondrial estimulam
mitofagia via quinase 1 induzida por PTEN (PINK1)/PARKIN. Concomitantemente, ROS são
neutralizados pela glutationa, um antioxidante chave. As ROS oxidam a glutationa e estimulam
s-glutationilização, uma modificação pós-traducional capaz de modular a função proteica.
Aqui, o objetivo foi explorar os mecanismos subjacentes à mitofagia, particularmente o papel
da sinalização de ROS e/ou glutationa na progressão da mitofagia, com foco especial na s-
glutationilização. Colocamos a hipótese que a mitofagia pode ser regulada pela sinalização da
glutationa, nomeadamente que a acumulação de ROS mitocondriais estimula a produção e
oxidação de glutationa, que estimula a mitofagia por S-glutationilização de proteínas relacio-
nadas com mitofagia. Em linhas celulares humanas, SH-SY5Y e SH-SY5Y mitoQC, disfunção
mitocondrial foi estimulada com
carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP). Geração
de ROS e mitofagia dependente de PINK1/PARKIN foram observados após tratamento com
CCCP. Igualmente, a subunidade catalítica da enzima limitante da síntese de glutationa, Gluta-
mato-Cisteína Ligase, é sobre-expressa em células tratadas com CCCP. Notavelmente, mostra-
mos que tratamento com CCCP induz glutationilização de PINK1. Além disso, também desco-
brimos que medir fluorescência num leitor de microplacas é uma possível técnica para avaliar
mitofagia. Compreender os mecanismos de mitofagia e como são regulados é fundamental
para estimular a citoproteção prevenindo a morte celular. E eventualmente contribuir para novas estratégias contra doenças caracterizadas por danos mitocondriais, como o acidente
vascular cerebral
