[ESP] Las necesidades metabólicas de las especies a cultivar tienen una 
gran importancia a la hora de programar el modo de cultivo para optimizar 
la productividad de los productos de interés. En este trabajo se presentan dos 
series de experimentos en los que se realiza un estudio de la influencia de la 
concentración de dos macronutrientes (nitrato y fosfato) en las principales 
variables de respuesta del cultivo del dinoflagelado Protoceratium 
reticulatum.Queremos expresar nuestro agradecimiento al Dr. José M. Franco y 
Dra. Beatriz Paz, del Centro Oceanográfico de Vigo, y a los Profesores 
Manuel Norte y J. Javier Fernández, del Instituto Universitario de Bio-
Orgánica Antonio González, por su inestimable ayuda en esta tarea del 
desarrollo de Bioprocesos relacionados con el cultivo masivo de 
dinoflagelados tóxicos para la producción de toxinas. Esta investigación está 
siendo financiada por el Ministerio de Educación y Ciencia (AGL2005-
07924-C04-04), España

Cerón, Mª Carmen

El Belarbi, Hassan

Gallardo, Juan J.

García, Francisco

Molina, Emilio

Sánchez, Asterio

Spanish

Repositorio Digital de la Universidad Politécnica de Cartagena

Avances y Tendencias en Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas                                           2008  Actas IX Reunión Ibérica sobre Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas. Gilabert J. (Ed.). Cartagena 7-10 Mayo 2007 137 Estudio de la influencia del contenido de macronutrientes  del medio en el crecimiento del dinoflagelado  Protoceratium reticulatum  Asterio Sánchez*, Juan J. Gallardo, Mª Carmen Cerón, Hassan El Belarbi, Francisco García y Emilio Molina Departamento de Ingeniería Química, Universidad de Almería; 04120 Almería * asmiron@ual.es, Tel. 950014025   Resumen Las necesidades metabólicas de las especies a cultivar tienen una gran importancia a la hora de programar el modo de cultivo para optimizar la productividad de los productos de interés. En este trabajo se presentan dos series de experimentos en los que se realiza un estudio de la influencia de la concentración de dos macronutrientes (nitrato y fosfato) en las principales variables de respuesta del cultivo del dinoflagelado Protoceratium reticulatum.  Introducción En los últimos años existe un gran interés por las toxinas producidas por ciertas especies de dinoflagelados tóxicos, ya que estas pueden utilizarse como estándares de referencia en las técnicas analíticas cualitativas y cuantitativas de alimentos marinos y posibles nuevos fármacos. El interés biotecnológico por estos microorganismos puede ser consultado en una revisión reciente [1]. Basándose en las expectativas despertadas por estos productos parece evidente la necesidad del desarrollo de la tecnología necesaria para la producción a media-gran escala de dichos compuestos. En este desarrollo se hace necesario abordar el problema de una manera conjunta mediante la optimización de las condiciones de cultivo, el estudio de las principales variables fisiológicas y la influencia de estas en la productividad de las toxinas de interés. El diseño de un sistema de cultivo óptimo se hace imprescindible pero no lo es menos el conocimiento de las necesidades metabólicas de la especie en cuestión para conseguir un proceso de producción adecuado. Se sabe que las proliferaciones naturales de dinoflagelados en las costas se desarrollan usualmente en condiciones de altas concentraciones de NO3-. El consumo de nitrato puede verse afectado por la cantidad de luz disponible [2]. Las células pueden liberar de nuevo al medio ciertas cantidades de NO3- no utilizadas en su metabolismo para poder consumir eficientemente el exceso de energía producida, ya que en caso contrario se produciría daño en el aparato fotosintético. En un trabajo reciente [3] se ha mostrado cómo la concentración celular y la velocidad de crecimiento de P. reticulatum aumentó al enriquecer el medio de cultivo base (L1) en nitratos y fosfatos. Teniendo en Avances y Tendencias en Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas                                           2008                      Actas IX Reunión Ibérica sobre Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas. Gilabert J. (Ed.). Cartagena 7-10 Mayo 2007 138 cuenta estos datos previos, la productividad celular podría verse influenciada por la disponibilidad en el medio de dichos macronutrientes. De hecho, estudios anteriores de asimilación a corto plazo de estos nutrientes con Gymnodinium catenatum [4] han mostrado que el consumo de los mismos depende de la concentración disponible y que la velocidad de crecimiento es proporcional a la cuota celular de nitrógeno y fósforo. Otros autores puntualizan que los datos de consumo celular de cualquier nutriente resulta ambiguo si no se aportan datos de volumen o radio celular [5]. Parece, pues, imprescindible, para el desarrollo de un proceso de producción a mediana-gran escala, determinar las necesidades celulares de N y P para poder realizar la optimización de las condiciones de cultivo de dinoflagelados.  Método de cultivo En este trabajo se realiza un estudio de la posible influencia de las concentraciones disponibles de nitratos y fosfatos sobre las principales variables celulares: concentración, velocidad de crecimiento, viabilidad y volumen celular. Para ello partiendo de la concentración del medio L1 se realizó una serie de experimentos variando la concentración de fosfato desde la concentración de dicho medio hasta 10 veces dicha concentración manteniendo constante la concentración de nitrato correspondiente a la formulación básica. En otra serie de experimentos se varió la concentración de nitrato en el medio desde la original hasta 10 veces dicho valor manteniendo la concentración de fosfato óptima de la primera serie. Se realizaron medidas diarias de concentración celular, concentración de nitrato y fosfato, diámetro celular promedio, viabilidad y actividad esterasa y auto-fluorescencia. Cada día se repuso la cantidad de nitrato y fosfato consumida hasta el momento de su medida. El contenido en toxinas se cuantificó al final de los ensayos. La especie cultivada fue P. reticulatum (GG1AM), amablemente cedida por el Dr. Franco del Instituto Oceanográfico de Vigo. Los cultivos se realizaron en frascos erlenmeyer estáticos y por duplicado bajo ciclo luz-oscuridad 12:12.  Resultados y discusión Los resultados obtenidos en la primera serie de experimentos mostraron, como cabía esperar [4], un consumo de fosfato tanto mayor cuanto mayor fue la concentración en el medio (Figura 1) y un descenso en dicho consumo con la edad del cultivo. No se observó influencia en la viabilidad celular hasta concentraciones superiores a 6 veces la concentración de la formulación del medio L1 (Figura 2), valor a partir del cual ocurrió una disminución casi lineal con la concentración mostrando cierta toxicidad por dicho nutriente (Figura 1). Hasta dicha concentración de fosfato la concentración celular y la velocidad de crecimiento aumentaron con el contenido en fosfato del medio mostrándose, por tanto, dicha concentración como óptima para el crecimiento celular. La velocidad Avances y Tendencias en Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas                                           2008  Actas IX Reunión Ibérica sobre Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas. Gilabert J. (Ed.). Cartagena 7-10 Mayo 2007 139 específica de crecimiento calculada a partir del volumen celular fue, en todos los casos, superior a la calculada a partir de la concentración celular y muy superior a las máximas referenciadas para esta especie.     Figura 1. Velocidad de consumo de fosfato y velocidad específica de crecimiento máxima en función del biovolumen generado frente a la concentración de fosfato utilizada en el medio.  El volumen celular creció de forma continuada con la edad del cultivo demostrando que la generación de biomasa es bastante superior a la generación de células y que los datos de crecimiento parece más adecuado expresarlos como biovolumen generado en lugar de células generadas. El consumo de nitrato mostró una evolución prácticamente independiente a la concentración de fosfato utilizada y sólo disminuyendo ligeramente a altas concentraciones de fosfato, posiblemente debido a la toxicidad celular mostrada por este nutriente. Aumentó ligeramente durante la fase exponencial temprana y disminuyó al final del cultivo. Evolución que indicaría que las células han de generar una cantidad de proteínas y/o enzimas relativamente alta para adaptarse a las nuevas condiciones de cultivo y, una vez adaptadas, las necesidades de nitrógeno no serían tan altas. [PO4-3]0, µM0 50 100 150 200 250 300 350 400ρ medio, pmol P·cél-1·h-10,00,20,40,60,81,0µ vol, d-10,200,250,300,350,400,45día 1 día 2 día 3 día 4 día 5 día 6 µvolAvances y Tendencias en Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas                                           2008                      Actas IX Reunión Ibérica sobre Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas. Gilabert J. (Ed.). Cartagena 7-10 Mayo 2007 140 t, d0 1 2 3 4 5 6 7 8Y Prelativo-10-8-6-4-20246Viabilidad relativa0,50,60,70,80,91,01,1Y 2X Y 4X Y 6X Y 8X Y 10X Viabilidad 2XViabilidad 4XViabilidad 6XViabilidad 8XViabilidad 10X Figura 2. Viabilidad y rendimiento celular relativos respecto al control (medio L1) para el primer experimento.  En la Fig. 3 se puede observar que, aparentemente, la cantidad de fosfato disponible no tiene influencia en el contenido celular de toxina, ya que en todas las concentraciones utilizadas no se observan diferencias significativas con el correspondiente al inóculo al inicio del experimento.  El ion fosfato, como se ha observado con otras especies [6], incrementa el crecimiento celular pero en esta especie parece no influir en las rutas de producción de yessotoxinas, incluso a concentraciones inhibitorias o tóxicas para el crecimiento. Sin embargo, como la productividad de toxina es proporcional a la concentración celular al utilizar una concentración de fosfato 6 veces superior a la concentración de L1 se maximizaría la productividad de toxinas.  Figura 3. Concentración celular de yessotoxinas frente a la concentración de fosfato en el medio para el primer experimento. [PO4-3]inóculo 1xL1 2xL1 4xL1 6xL1 8xL1 10xL1[YTX], pg·cél-1012345Avances y Tendencias en Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas                                           2008  Actas IX Reunión Ibérica sobre Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas. Gilabert J. (Ed.). Cartagena 7-10 Mayo 2007 141 Para la segunda serie de experimentos se utilizó la concentración de fosfato óptima (6 veces la correspondiente al medio L1). No se apreció diferencia en la velocidad específica de crecimiento ni en la viabilidad celular con la concentración de nitrato utilizada. Sólo a partir de las concentraciones 4 veces superiores a las correspondientes al medio L1 se apreció la aparición de fase estacionaria a partir del sexto día, mientras que para las concentraciones original y dos veces superior no aparece esta fase estacionaria. Este comportamiento indicaría que a partir del sexto día hay algún otro nutriente que está limitando el crecimiento como el CO2 o algún micronutriente. Se observó un consumo de fosfato independiente de la concentración de nitrato utilizada pero que disminuyó de una forma continuada con el tiempo, como ocurriera en el ensayo anterior. El consumo de nitrato no sigue una tendencia generalizada ni con la concentración ni con el tiempo. Como ya se observó en un trabajo anterior [3] hay cierta liberación de nitrato al medio lo que hace que haya días de velocidad de consumo (Fig. 4) y rendimiento celular negativo. Sí se observa un consumo importante durante la fase lag, que duró dos días, y tanto más cuanto mayor fue la concentración disponible, cierta liberación durante la fase exponencial pura, un consumo reducido durante la fase lineal y liberación en la fase estacionaria. Estos fenómenos se vieron tanto más acusados cuanto mayor fue la concentración de nitrato ensayada (Fig. 4).    Figura 4. Velocidad específica de consumo de nitrato en función del tiempo frente a la concentración inicial en el medio. [NO3-]0, µM0 2000 4000 6000 8000 10000ρ medio, pmol N·cél-1·h-1-2,0-1,5-1,0-0,50,00,51,01,52,02,53,0día 1 día 2 día 3 día 4 día 5día 6 día 8 Avances y Tendencias en Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas                                           2008                      Actas IX Reunión Ibérica sobre Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas. Gilabert J. (Ed.). Cartagena 7-10 Mayo 2007 142  Figura 5. Concentración celular de yessotoxinas frente a la concentración de nitrato utilizada en el segundo experimento.  En la Fig. 5 se puede apreciar que hay cierta estimulación en la producción de toxinas a partir de concentraciones de nitrato 4 veces superiores al cultivo control (L1). La disponibilidad de nitrato a partir de la concentración correspondiente al medio L1 no parece influir sobre la producción celular pero a altas concentraciones estimula la producción de toxinas, a pesar de que estas moléculas no contienen nitrógeno. Quizás la entrada en fase estacionaria a altas concentraciones de nitrato por limitación de otro nutriente pueda estimular las rutas metabólicas de producción de toxinas.  Agradecimientos Queremos expresar nuestro agradecimiento al Dr. José M. Franco y Dra. Beatriz Paz, del Centro Oceanográfico de Vigo, y a los Profesores Manuel Norte y J. Javier Fernández, del Instituto Universitario de Bio-Orgánica Antonio González, por su inestimable ayuda en esta tarea del desarrollo de Bioprocesos relacionados con el cultivo masivo de dinoflagelados tóxicos para la producción de toxinas. Esta investigación está siendo financiada por el Ministerio de Educación y Ciencia (AGL2005-07924-C04-04), España.  Bibliografía [1] Camacho, F.G., J.G. Rodríguez, A.S. Mirón, M.C.C. García, E.H. Belarbi, Y. Chisti, E.M. Grima. 2007. Biotechnological significance of toxic marine dinoflagellates. Biotechnology Advances. 25:176-194. [NO3-]inóculo 1xL1 2xL1 4xL1 6xL1 8xL1 10xL1[YTX], pg·cél-101234567Avances y Tendencias en Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas                                           2008  Actas IX Reunión Ibérica sobre Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas. Gilabert J. (Ed.). Cartagena 7-10 Mayo 2007 143 [2] Lomas, M.W., P.M. Glibert. 1999. Interactions between NH4+ and NO3- uptake and assimilation: Comparison of diatoms and dinoflagellates at several growth temperatures. Mar. Biol. 133:541-551. [3] Gallardo Rodríguez, J.J., M.C. Cerón García, F. García Camacho, A. Sánchez Mirón, E.H. Belarbi, E. Molina Grima. 2007. New culture approaches for yessotoxin production from the  dinoflagellate Protoceratium reticulatum. Biotechnol. Progr. 23:339-350.  [4] Yamamoto, T., Y. Kataoka, S.J. Oh. 2004. Growth and uptake kinetics for nitrate, ammonium and phosphate by the toxic dinoflagellate Gymnodinium catenatum isolated from Hiroshima Bay, Japan. Fisheries Science. 70:108-115. [5] Lomas, M.W., P.M. Gilbert. 2000. 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Estudio de la influencia del contenido de macronutrientes   del medio en el crecimiento del dinoflagelado   Protoceratium reticulatum

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