Prostate cancer is one of the most frequent cancers diagnosed in males, predicted to
become the most prevalent malignancy in upcoming years. Current therapies have
limited efficacy and are not suitable to mitigate the alarming incidence and mortality
rates, especially in later hormone-refractory stages. In this manner, it is crucial the
development of novel approaches. Six-Transmembrane Epithelial Antigen of the
Prostate 1 (STEAP1) is a protein highly overexpressed in PCa predicted to function as a
transmembrane transporter and ionic channel, to play a role in intercellular
communication between tumor cells and has been associated with the generation and
propagation of high levels of reactive oxygen species. Consequently, STEAP1 leads to
increased cellular proliferation and tumor aggressiveness. Furthermore, STEAP1 is
mostly absent from normal tissues, suggesting a specificity for the cancer
microenvironment, indicating that STEAP1 could have potential as a biomarker and
therapeutic target. However, to explore this potential it is first necessary to isolate stable,
bioactive and pure protein fractions of high concentration. Thus, we prepared calciumand nickel-crosslinked gellan gum microspheres through a water-in-oil emulsion with
1.41% (w/v) gellan at 750 rpm and 100ºC. The microspheres were characterized trough
FTIR, SEM and EDX, ensuring adequate size, morphology, and crosslinking. The
microspheres were used to capture STEAP1 solubilized in 0.1% (v/v) DM derived from
Komagataella pastoris X33 Mut+ mini-bioreactor lysates using two different
approaches, exploring ionic and affinity interactions. The ionic strategy presented the
best results and consisted of STEAP1 capture in 10 mM MES buffer at pH 6.2. The target
was then eluted by electrostatic repulsion with 10 mM Tris supplemented with 500 mM
NaCl at pH 11. These optimized conditions allowed the recovery of STEAP1 in a single
step, eliminating heterologous proteins in intermediary steps. The clarified fraction was
polished by coupling with a Co-immunoprecipitation step. This technique was able to
decomplex STEAP1-gellan gum complexes formed during the batch clarification. This
innovative integration results in a monomeric STEAP1 fraction with high purity degree.O cancro da próstata é um dos cancros mais frequentemente diagnosticados no sexo
masculino, prevendo tornar-se a neoplasia maligna mais prevalente nos próximos anos.
As terapias atuais têm eficácia limitada e não são suficientemente adequadas para
mitigar as alarmantes taxas de incidência e mortalidade (aproximadamente 1.4 e 0.38
milhões, respetivamente) especialmente em fases mais avançadas não responsivas a
tratamento hormonal. Desta forma, é crucial o desenvolvimento de novas abordagens de
diagnóstico e terapêuticas. A Six-Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate 1
(STEAP1) é uma proteína sobre-expressa no cancro da próstata, funcionando como um
transportador transmembranar e canal iónico e desempenhando um papel na
comunicação intercelular entre células tumorais. Adicionalmente, esta proteína foi
associada com elevados níveis celulares de espécies reativas de oxigénio.
Consequentemente, a sobre-expressão de STEAP1 leva ao aumento da proliferação
celular e agressividade do tumor. Além disso, a STEAP1 está maioritariamente ausente
em tecidos normais e órgãos vitais, sugerindo uma especificidade para o microambiente
tumoral, indicando que esta proteína membranar pode ser considerada um potencial
biomarcador e alvo terapêutico. No entanto, para explorar esse potencial, é necessário
isolar frações de STEAP1 estáveis, bioativas e puras em concentrações elevadas.
Atualmente, a principal limitação dos bioprocessos de natureza recombinante está
relacionada com a fase de downstream, sendo que estas etapas contabilizam
aproximadamente 80% dos custos totais. As etapas cromatográficas efetuadas em modo
sequencial na purificação de STEAP1 não produzem rendimentos apropriados para a
cristalização desta proteína e consequentemente promover a determinação da estrutura
3D e o desenvolvimento estudos de biointeração com antagonistas emergentes. Assim, o
método batch surge como uma alternativa, considerando que é um método largamente
aplicado na indústria, sendo capaz de combinar as etapas de clarificação, concentração e
purificação primária de proteínas numa única etapa. Paralelamente, este método é
simples, rápido e de baixo custo. A goma gelana é um exopolissacarídeo aniónico que
tem a capacidade de formar géis termorreversíveis na presença de catiões divalentes.
Desde a sua descoberta, este polímero foi aplicado com sucesso na indústria alimentar,
farmacêutica e biotecnológica. Recentemente, foi demonstrada a aplicabilidade da
gelana como matriz cromatográfica, devido a ser um polímero poroso, hidrofílico e
possuir elevada capacidade de ligação. Este conceito foi também aplicado na formulação
de microesferas de gelana para a captura de proteínas solúveis e pDNA. Assim, o
principal objetivo deste trabalho foi desenvolver e otimizar um método de batch
utilizando microesferas de gelana para a captura de STEAP1, uma proteína transmembranar, diretamente de um lisado bruto de Komagataella pastoris X33 Mut+.
Para atingir este objetivo, as microesferas de gelana foram preparadas através do método
de emulsão água-em-óleo pela extrusão de uma solução de 1.41% de gelana previamente
aquecida a 90ºC sobre uma solução de óleo a 750 rpm e 100ºC. As microesferas foram
reticuladas com cálcio e níquel, correspondendo aos tipos de estratégias iónica e de
afinidade exploradas no batch, respetivamente. As microesferas foram caracterizadas
relativamente ao diâmetro médio (microscopia semiótica), à morfologia (SEM) e
composição química (FTIR e EDX). Os resultados obtidos demonstram que as
microesferas apresentam uma morfologia esférica com uma estrutura uniforme e
consistente, com tamanhos médio de 239.06 µm (níquel) e 330.37 µm (cálcio). O EDX
demonstrou uma maior percentagem de integração de níquel, quando comparado com
microesferas de gelana reticuladas com cálcio, justificando o menor tamanho destas
microesferas pela formação de uma rede tridimensional mais compacta. Os espectros de
FTIR juntamente com as percentagens iónicas obtidas por EDX demonstram o sucesso
da etapa de reticulação. Em relação ao batch, várias otimizações foram realizadas visto
que a STEAP1 apresentou alguma tendência de formar complexos estáveis com a gelana.
Inicialmente, foi demonstrado que o detergente DM, a uma concentração de 0.1% (v/v),
permitiu a solubilização mais eficaz e, por conseguinte, maior grau de recuperação de
STEAP1. Posteriormente, a concentração ideal de lisado a injetar na matriz de gelana,
correspondeu a ~7 mg de proteína total/mL, ou seja, uma diluição de 1:6 (concentração
de lisado bruto de ~43 mg/mL) por cada produção de batch. Por último, verificou-se que
35 mL de microesferas de gelana para 6 mL de tampão é o rácio ideal a utilizar no método
de captura em modo batch. As microesferas reticuladas com níquel foram utilizadas para
a estratégia de afinidade. Surpreendentemente, a pH 9.2 foi possível ligar a totalidade de
STEAP1 explorando a afinidade da sua cauda de histidinas aos iões de níquel presentes
na superfície das microesferas de gelana. No entanto, no método de batch a STEAP1
provou ser sensível mesmo a modestas concentrações de imidazole e não foi possível
recuperar a proteína alvo numa única fração. Contrariamente, as microesferas de cálcio
utilizadas na estratégia iónica produziram resultados mais encorajadores. De facto, a
STEAP1 liga totalmente a pH 6.2 em 10 mM MES e elui numa única fração na presença
de 500 mM NaCl a pH 11 em 10 mM Tris. No entanto, não foi possível eliminar
totalmente a formação de complexos STEAP1-gelana, mesmo com a implementação de
várias etapas de otimização, nomeadamente, solubilização, concentração de lisado, rácio
de microesferas e nas etapas do batch, bem como das suas respetivas concentrações de
NaCl. Para descomplexar a STEAP1 da gelana, as frações recuperadas do batch iónico
foram acopladas a uma etapa de polimento de co-imunoprecipitação, descomplexando
os agregados STEAP1-gelana que resultaram numa fração de STEAP1 na forma monomérica (~35 kDa) de elevado grau de pureza. Desta forma, demonstramos uma
integração inovativa baseada no método de batch de gelana com uma etapa de coimunoprecipitação que resulta na captura, clarificação e purificação de STEAP1
