Role of the ceramide metabolism in TNF-induced melanoma dedifferentiation

Abstract

Le mélanome cutané est un cancer de la peau agressif de par, notamment, son fort potentiel métastatique. L'utilisation des inhibiteurs de points de contrôle immunitaire (ICI), anti-PD-1 et anti-CTLA-4, a révolutionné la prise en charge des patients atteints de mélanome avancé. Cependant, la moitié de ces patients ne répond pas aux traitements ou rechute. Notre équipe a récemment mis en évidence que le TNF, une cytokine pro-inflammatoire produite par les cellules immunitaires, participe à la mise en place de ces résistances. En effet, l'utilisation d'anticorps ciblant le TNF améliore considérablement l'efficacité des anti-PD-1 dans un modèle murin de mélanome. Dans un contexte d'immunothérapie, le TNF peut induire la mort suite à l'activation (AICD) des lymphocytes T cytotoxiques ainsi que l'expression de points de contrôle immunitaire secondaire tel que Tim-3. De plus, le TNF peut également agir directement sur les cellules de mélanome, et entrainer leur dédifférenciation. Ce mécanisme très semblable à la transition épithélio-mesenchymateuse, se marque par la diminution du facteur de transcription MITF et de l'expression des antigènes mélanocytaires. Parallèlement, le TNF est un modulateur du métabolisme du céramide. Or, notre laboratoire a également mis en évidence que des perturbations de ce métabolisme impactent la résistance aux immunothérapies. En effet, l'inhibition de la sphingosine kinase 1, responsable de la production de S1P, ou encore la surexpression de la sphingomyélinase neutre 2, favorisant la production de céramide, améliore l'efficacité des anti-PD-1 et anti-CTLA-4 dans des modèles murins de mélanome. De plus, des études récentes suggèrent un rôle du métabolisme du céramide dans la dédifférenciation du mélanome. Au vu de l'étroite relation entre le TNF et le métabolisme du céramide, ainsi que leur rôle respectif dans la mise en place de résistance aux ICI, l'objectif général de ma thèse consistait donc à étudier le rôle du métabolisme du céramide dans la dédifférenciation du mélanome induite par le TNF. Dans un premier temps, nous avons observé que la dédifférenciation du mélanome induite par le TNF est associée à une augmentation globale de la biosynthèse des sphingolipides. Plus spécifiquement, le TNF diminue l'expression et l'activité de la céramidase acide, enzyme centrale de la dégradation du céramide. De manière intéressante, l'étude rétrospective de cohortes de patients atteints de mélanome avancé traités par anti-PD-1, met en évidence une expression de la céramidase acide diminuée dans les tumeurs classées comme transitoires ou dédifférenciées. En ce sens, nous montrons que la diminution de la céramidase acide par une stratégie de siARN, induit par elle-même la dédifférenciation du mélanome vers un état transitoire. A l'inverse, la surexpression de la céramidase acide dans une lignée de mélanome ayant un phénotype transitoire augmente l'état de différenciation et atténue la dédifférenciation du mélanome induite par le TNF. La diminution de la céramidase acide participe donc au phénomène de dédifférenciation induit par le TNF. De façon plus globale, nous montrons que le TNF induit l'accumulation de divers métabolites, dont les lactosylcéramides. Alors que le céramide et la sphingosine exogène déclenchent la dédifférenciation des cellules de mélanome, l'inhibition de la synthèse du céramide et des glycosphingolipides entrave la dédifférenciation des cellules de mélanome induite par le TNF. L'analyse du contenu plasmatique en sphingolipides chez les patients atteints de mélanome avancé indique que les lactosylcéramides sont enrichis chez les non-répondeurs à l'immunothérapie. Ainsi, cette thèse montre que les changements du métabolisme du céramide sont impliqués dans la dédifférenciation des cellules de mélanome induite par le TNF et pourraient participer à la résistance aux inhibiteurs de points de contrôle immunitaire.Cutaneous melanoma is an aggressive skin cancer with a high metastatic potential. The use of immune checkpoint inhibitors (ICI), targeting PD-1 and CTLA-4, has revolutionized the management of patients with advanced melanoma. However, half of these patients do not respond to treatment or relapse. Our team has recently demonstrated that TNF, a pro-inflammatory cytokine produced by immune cells, is involved in the development of this resistance. Indeed, the use of antibodies targeting TNF significantly improves the efficacy of anti-PD-1 in a mouse model of melanoma. In the context of immunotherapy, TNF can lead to the activation-induced cell death (AICD) of cytotoxic T cells and the expression of secondary immune checkpoints such as Tim-3. In addition, TNF can also directly act on melanoma cells, leading to their dedifferentiation. This mechanism is very similar to the epithelial to mesenchymal transition and is marked by a decreased expression of the transcription factor MITF and of melanocytic antigens. In parallel, TNF is a modulator of ceramide metabolism. Our laboratory has also demonstrated that alterations of this metabolism have an impact on the resistance to immunotherapies. Indeed, inhibition of sphingosine kinase 1, responsible for S1P production, or overexpression of neutral sphingomyelinase 2, which promotes ceramide production, improves the efficacy of anti-PD-1 and anti-CTLA-4 in murine melanoma models. In addition, recent studies suggest a role for the ceramide metabolism in melanoma dedifferentiation. Given the close relationship between TNF and the ceramide metabolism, as well as their respective roles in the development of ICI resistance, the general objective of my PhD was to investigate the role of ceramide metabolism in TNF-induced melanoma dedifferentiation. First, we observed that TNF-induced melanoma dedifferentiation is associated with an overall increase in sphingolipid biosynthesis. More specifically, TNF decreases the expression and activity of acid ceramidase, a central enzyme able to catalyse ceramide degradation. Interestingly, a retrospective study on tumours from 3 cohorts of advanced melanoma patients treated with anti-PD-1, shows a reduces expression of acid ceramidase in tumours classified as transitory or dedifferentiated. In accordance, we show that the decrease of acid ceramidase by a siRNA induces, on its own, the dedifferentiation of melanoma cells towards a more transitory state. Conversely, overexpression of acid ceramidase in a melanoma cell line with a transitory phenotype increases the differentiation state and attenuates TNF-induced melanoma dedifferentiation. The decrease of acid ceramidase thus participates in the TNF-induced dedifferentiation phenomenon. More globally, we show that TNF induces the accumulation of various/a number of metabolites, including lactosylceramides. While exogenous ceramide and sphingosine trigger melanoma cell dedifferentiation, inhibition of ceramide and glycosphingolipid synthesis impedes TNF-induced melanoma cell dedifferentiation. Analysis of plasma sphingolipid content in advanced melanoma patients indicates that lactosylceramides are enriched in non-responders to immunotherapy. Thus, our work shows that changes in ceramide metabolism are involved in the TNF-induced dedifferentiation of melanoma cells and may participate in the resistance to immune checkpoint inhibitors