Evaluation of the intestinal toxicity of Versicolorin A, a precursor of Aflatoxin B1

Abstract

Les mycotoxines sont des métabolites secondaires toxiques produits par des champignons filamenteux, responsables de la contamination des denrées alimentaires et des produits destinés à la consommation animale. Parmi les mycotoxines identifiées, l'aflatoxine B1 (AFB1) est considérée comme le cancérigène naturel le plus puissant. Au cours de la biosynthèse de l'AFB1, plusieurs précurseurs sont produits tels que la versicolorine A (VerA). La VerA possède un système cyclique furofurane similaire à celui de l'AFB1 et d'autres précurseurs génotoxiques de l'AFB1. VerA a été signalé comme étant génotoxique et cytotoxique pour diverses lignées cellulaires, mais les informations sur la toxicité sont rares. Son potentiel génotoxique et la forte probabilité qu'il s'accumule et coexiste avec l'AFB1 dans les aliments justifient notre intérêt à évaluer la toxicité du VerA dans l'intestin, première barrière en contact avec les mycotoxines après ingestion. Le premier objectif était d'identifier les métabolites issus de la biotransformation du VerA. Il est bien établi que la transformation in vivo de l'AFB1 est une étape clé pour leur génotoxicité. En revanche, aucune information n'est disponible sur la metabolisation du VerA. Nous avons obtenu la première bibliothèque de métabolites de VerA, en incubant du VerA purifié avec des fractions S9 de foie humain en présence de cofacteurs appropriés, suivi d'une analyse UPLC-HRMS. Les données analytiques obtenues ont ensuite été utilisées pour identifier les métabolites de la VerA produits dans des lignées cellulaires intestinales différenciées in vitro ainsi que dans des tissus intestinaux et hépatiques exposés ex vivo. Des métabolites appartenant aux métabolites de phase I et de phase II du VerA ont été détectés. Les résultats ont révélé un métabolite compatible avec la bioactivation du VerA et ses effets génotoxiques, ainsi que des voies de détoxification potentielles.Le second objectif était d'évaluer la mutagénicité et la génotoxicité du VerA. Nous avons particulièrement étudié le rôle de l'activation métabolique dans la mutagénicité en raison de sa pertinence pour la toxicité des mycotoxines bisfuranoïdes. En outre, nous avons étudier la génotoxicité du VerA dans les cellules épithéliales intestinales. Nos résultats indiquent que l'activation métabolique de VerA est essentielle pour sa mutagénicité. De plus, il a été démontré que cette toxine est également hautement génotoxique et induit des dommages à l'ADN même à faible dose au niveau intestinal. Outre l'instabilité chromosomique, VerA induit une augmentation des cassures de brins d'ADN, des dommages oxydatifs ainsi que des signes de stress de réplication. Nos résultats de génotoxicité suggèrent que les mécanismes de toxicité de VerA et AFB1 sont différentiels.Le troisième objectif de cette thèse était d'évaluer les changements précoces du transcriptome induits par la VerA et l'AFB1 dans les cellules épithéliales intestinales différenciées. Nos résultats ont confirmé que, contrairement à l'AFB1, la VerA induit des changements profonds dans les profils d'expression génique globaux des cellules exposées. En plus des changements liés aux éléments connus de la toxicité du VerA (stress oxydatif, apoptose et génotoxicité), nous avons également détecté de nouvelles voies spécifiquement exprimées par la VerA. Nos résultats suggèrent que la VerA a induit un dysfonctionnement mitochondrial lié à l'induction d'une réponse interféron de type 1 médiée par cGAS-STING. En outre, la VerA a modifié l'expression de gènes impliqués dans la régulation de la forme et de l'adhésion des cellules. Ces données confirment que la toxicité du VerA est beaucoup plus complexe que celle de l'AFB1. Dans l'ensemble, la VerA est une mycotoxine émergente hautement toxique. Les résultats du présent projet de thèse de doctorat fournissent des informations importantes sur la toxicité du VerA dans l'intestin et contribueront à caractériser le danger associé à son exposition.Mycotoxins are toxic secondary metabolites produced by filamentous fungi, responsible for the contamination of food and feed products. Among the identified mycotoxins, aflatoxin B1 (AFB1) is considered as the most potent natural carcinogen responsible in particular for the induction of liver cancer. During the biosynthesis of AFB1, several precursors are produced such as versicolorin A (VerA). VerA has a furofuran ring system similar to that of AFB1 and other genotoxic AFB1 precursors (known as bisfuranoid mycotoxins). VerA has been reported to be genotoxic and cytotoxic to various cell lines, but information on toxicity is scarce. Its genotoxic potential and the high probability that it accumulates and coexists with AFB1 in food justify our interest in evaluating the toxicity of VerA in the intestine, the first barrier in contact with mycotoxins after ingestion. The first objective of this PhD thesis was to identify the metabolites resulting from the biotransformation of VerA. It is well established that the in vivo transformation of AFB1 and other bisfuranoid precursors are a key step for their genotoxicity. In contrast, no information is available on the metabolisation of VerA nor the importance of its bioactivation for its toxicity. We obtained the first library of VerA metabolites, by incubating purified VerA with human liver S9 fractions in the presence of appropriate cofactors, followed by UPLC-HRMS analysis. The analytical data obtained were then used to identify VerA metabolites produced in differentiated intestinal cell lines (IPEC1) in vitro as well as intestinal and liver tissues exposed ex vivo to different times and concentrations of VerA. Metabolites belonging to phase I and phase II metabolites of VerA were detected. Results revealed a metabolite consistent with the bioactivation of VerA and its genotoxic effects, as well as revealed potential detoxification pathways (glucuronidation and sulfation).The second objective of this PhD thesis was to evaluate the mutagenicity and genotoxicity of VerA. We particularly studied the role of metabolic activation in mutagenicity because of its relevance to the toxicity of bisfuranoid mycotoxins. In addition, we used a battery of tests to investigate the genotoxicity of VerA in intestinal epithelial cells. Our results indicate that the metabolic activation of VerA is essential for its mutagenicity. Furthermore, it was shown that this toxin is also highly genotoxic and induces DNA damage even at low doses at the intestinal level. Besides chromosomal instability, VerA induces increased DNA strand breaks, oxidative damage as well as signs of replication stress. Our genotoxicity results suggest that the mechanisms of toxicity of VerA and AFB1 are different.The third objective of this PhD thesis was to evaluate the early transcriptome changes induced by VerA and AFB1 in differentiated intestinal epithelial cells. Our results confirmed that, as opposed to AFB1, VerA induced profound changes in the overall gene expression profiles of exposed cells. In addition to changes related to known elements of VerA toxicity (oxidative stress, apoptosis and genotoxicity), we also detected novel pathways specifically expressed and induced by VerA. Our results suggest that VerA induced a mitochondrial dysfunction related to the induction of a cGAS-STING-mediated type 1 interferon response. In addition, VerA affected changes in the expression of genes involved in the regulation of cell shape and adhesion. These data confirm that the toxicity of VerA is much more complex than that of AFB1. Taking together, VerA is highly toxic emerging mycotoxin. The results of the present PhD thesis project provide important information regarding the toxicity of VerA in the intestine and will contribute to characterize the danger associated with its exposure