Molekulární mechanizmy formování a funkce BBSomu

Abstract

Bardet Biedl syndrome is a genetic disorder caused by the dysfunction of the BBSome, an octameric cargo adaptor protein complex. The BBSome facilitates the transport of signaling receptors into and out of the primary cilium, a microtubule based sensory organelle of the cell. The first part of this thesis focuses on the elucidation of the assembly of the BBSome in living cells. We generated a library of human and mouse cells lines deficient in the individual BBSome subunits and transduced them with the other YFP tagged subunits. We employed biochemical assays, immunofluorescence and quantitative fluorescence microscopy techniques to analyze the individual steps in the BBSome assembly pathway. We revealed that the BBSome assembly occurs sequentially in spatially regulated steps. We showed that BBS4 nucleates the assembly of a pre-BBSome at the pericentriolar satellites. The translocation of the pre-BBSome to the ciliary base is facilitated by BBS1. We also revealed that in a BBS chaperonin deficient cell line, BBS12 KO cells, a small fraction of the BBSome and/or BBSome sub-complexes are still able to form and localize to the cilium. This could suggest that the BBS chaperonins might act later in the BBSome assembly pathway providing a means for quality control for the BBSome. Ciliary ectocytosis...Bardetův Biedlův syndrom (BBS) je genetická porucha způsobená dysfunkcí BBSomu, což je oktamerický adaptorový proteinový komplex. BBSome transportuje signální receptory dovnitř a ven z cílií, což jsou senzorické buněčné organely vystavěné na V první části práce jsme se zaměřili na objasnění formování BBSomu v živých buňkách. Vytvořili jsme knihovnu lidských a myších buněčných linií, kterým chyběly jednotlivé podjednotky BBSomu a vnesli jsme do nich ostatní podjednotky označené YFP proteinem. K analýze jednotlivých kroků formování BBSomu jsme použili biochemické testy, imunofluorescenci a kvantitativní fluorescenční mikroskopii. Odhalili jsme, že sestavování BBSomu probíhá postupně v různých částech buňky. Ukázali jsme, že BBS4 iniciuje rních satelitech. Přemístění pre bázi a finální zkompletování BBSomu umožňuje BBS1. Odhalili jsme také, že v buňkách, kde chybí BBS12 chaperonin, se formuje malá část BBSomu a/nebo subkomplexů . To naznačuje, že BBS chaperoniny zajištují Ciliární ektocytóza odstraňuje přebytečné ciliární signální receptory prostřednictvím odštěpení apikální části ciliární membrány, což je regulované polymerizací aktinu. Faktory které spouštějí polymerizaci aktinu v místě ektocytózy, zůstávají neznámé. Ve druhé části práce jsme odhalili, že CDC42, člen rodiny RHO GTPáz, spouští polymerizaci...Katedra buněčné biologieDepartment of Cell BiologyFaculty of SciencePřírodovědecká fakult