[ESP] La emergencia y prevalencia de enfermedades virales en los cultivos requiere una 
vigilancia epidemiológica, y entender cómo los procesos ecológicos y evolutivos influyen 
en las dinámicas de las poblaciones virales. El objetivo fue monitorizar la presencia de seis 
virus transmitidos por pulgón en plantas sintomáticas de melón y calabacín en España 
durante 2011 y 2020. Observamos que el virus del amarilleo transmitido por pulgón en 
cucurbitáceas (CABYV) y el virus del mosaico de la sandía (WMV) son los virus mayoritarios 
en estos cultivos, incluyendo una alta proporción de infecciones mixtas. Además, se 
caracterizó molecularmente el genoma completo de 24 aislados de CABYV y 22 de WMV, 
observando que las poblaciones estaban estructuradas temporalmente, sin diferenciación 
entre su procedencia. Sin embargo, la variación temporal de CABYV fue en parte por el tipo 
de infección (simple o mixta), sugiriendo que las infecciones mixtas pueden tener un papel 
relevante en la epidemiología de las enfermedades causadas por CABYV. [ENG] The emergence and prevalence of viral diseases in crops requires systematic 
epidemiological surveillance, in addition to understand how ecological and evolutionary 
process influence virus population dynamics. In this work, we monitored the presence of 
six aphid-borne viruses in symptomatic melon and zucchini plants in Spain from 2011 to 
2020. We found that cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV) and watermelon mosaic 
virus (WMV) are the most common viruses affecting these crops, with a high proportion of 
mixed infections. We performed a molecular analysis the whole genome of 24 CABYV and 
22 WMV isolates. We observed both populations were a fine-scale temporal structure, 
without distinction between their origins. However, CABYV temporal variation was partly 
explain by infection type (single or mixed), suggesting mixed infections may play a relevant 
role in the epidemiology of CABYV diseases.Ministerio de ciencia, innovación y universidades con beca de doctorado (PRE2018-083915). 
AGL2017-89550-R de la Agencia Estatal de Investigación (AEI) y fondos FEDER (UE)

Gómez, P.

Juárez, M.

Rabadán, M.P.

Spanish

[SPA] La emergencia y prevalencia de enfermedades virales en los cultivos requiere una 
vigilancia epidemiológica, y entender cómo los procesos ecológicos y evolutivos influyen 
en las dinámicas de las poblaciones virales. El objetivo fue monitorizar la presencia de seis 
virus transmitidos por pulgón en plantas sintomáticas de melón y calabacín en España 
durante 2011 y 2020. Observamos que el virus del amarilleo transmitido por pulgón en 
cucurbitáceas (CABYV) y el virus del mosaico de la sandía (WMV) son los virus mayoritarios 
en estos cultivos, incluyendo una alta proporción de infecciones mixtas. Además, se 
caracterizó molecularmente el genoma completo de 24 aislados de CABYV y 22 de WMV, 
observando que las poblaciones estaban estructuradas temporalmente, sin diferenciación 
entre su procedencia. Sin embargo, la variación temporal de CABYV fue en parte por el tipo 
de infección (simple o mixta), sugiriendo que las infecciones mixtas pueden tener un papel 
relevante en la epidemiología de las enfermedades causadas por CABYV.Ministerio de ciencia, innovación y universidades con beca de doctorado (PRE2018-083915). 
AGL2017-89550-R de la Agencia Estatal de Investigación (AEI) y fondos FEDER (UE)

Rabadán Manzanera, Pilar

Juárez Marcos, Mariano

Martínez Gómez, Pedro

Repositorio Digital de la Universidad Politécnica de Cartagena

11º Workshop en Investigación Agroalimentaria para jóvenes investigadores. Cartagena, 20 de junio 2022 45  Prolongada monitorización y dinámica genética del virus del amarillo transmitido por pulgón de las cucurbitáceas y el virus del mosaico de la sandía en cultivos de melón y calabacín Long-term monitoring and genetic dynamics of cucurbit aphid-borne yellows virus and watermelon mosaic virus in melon and zucchini crops M.P. Rabadán*1, M. Juárez2, P. Gómez1 1Departamento de Biología del Estrés y Patología Vegetal. Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura (CEBAS)-CSIC. PO Box 164, 30100, Espinardo, Murcia, España. 2Centro de Investigación e Innovación Agroalimentaria y Agroambiental (CIAGRO). Departamento de Producción Vegetal y Microbiología. Universidad Miguel Hernández de Elche, 03312, Orihuela, Alicante, España. *mprabadan@cebas.csic.es Resumen La emergencia y prevalencia de enfermedades virales en los cultivos requiere una vigilancia epidemiológica, y entender cómo los procesos ecológicos y evolutivos influyen en las dinámicas de las poblaciones virales. El objetivo fue monitorizar la presencia de seis virus transmitidos por pulgón en plantas sintomáticas de melón y calabacín en España durante 2011 y 2020. Observamos que el virus del amarilleo transmitido por pulgón en cucurbitáceas (CABYV) y el virus del mosaico de la sandía (WMV) son los virus mayoritarios en estos cultivos, incluyendo una alta proporción de infecciones mixtas. Además, se caracterizó molecularmente el genoma completo de 24 aislados de CABYV y 22 de WMV, observando que las poblaciones estaban estructuradas temporalmente, sin diferenciación entre su procedencia. Sin embargo, la variación temporal de CABYV fue en parte por el tipo de infección (simple o mixta), sugiriendo que las infecciones mixtas pueden tener un papel relevante en la epidemiología de las enfermedades causadas por CABYV. Palabras clave: Cucurbitaceae; epidemiología molecular; variabilidad genética; infecciones mixtas. Abstract The emergence and prevalence of viral diseases in crops requires systematic epidemiological surveillance, in addition to understand how ecological and evolutionary process influence virus population dynamics. In this work, we monitored the presence of six aphid-borne viruses in symptomatic melon and zucchini plants in Spain from 2011 to 2020. We found that cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV) and watermelon mosaic virus (WMV) are the most common viruses affecting these crops, with a high proportion of mixed infections. We performed a molecular analysis the whole genome of 24 CABYV and 22 WMV isolates. We observed both populations were a fine-scale temporal structure, without distinction between their origins. However, CABYV temporal variation was partly explain by infection type (single or mixed), suggesting mixed infections may play a relevant role in the epidemiology of CABYV diseases. Keywords: Cucurbitaceae; molecular epidemiology; genetic variability; mixed infections. 11º Workshop en Investigación Agroalimentaria para jóvenes investigadores. Cartagena, 20 de junio 2022 46  1. INTRODUCCIÓN Las enfermedades causadas por virus de plantas tienen el potencial de originar epidemias con graves consecuencias para la producción agrícola. Los avances en las técnicas de secuenciación proporcionan una gran ayuda al estudio del viroma de cultivos, lo que está permitiendo, no solo identificar nuevos virus, sino que también revelar la co-detección de un rango de virus en la misma planta y cultivo como parte de un complejo de infecciones mixtas. Dada la elevada frecuencia con la que aparecen infecciones mixtas de virus, estas infecciones se están reconociendo como un factor biótico que puede influir en la evolución y ecología de estas enfermedades en el campo (1,2).  En el caso de enfermedades virales afectando a los cultivos de cucurbitáceas, el virus del amarilleo de las cucurbitáceas transmitido por pulgón (cucurbit aphid-borne yellows virus; CABYV), junto con el virus del mosaico de la sandía (watermelon mosaic virus; WMV) son conocidos por estar entre los virus con mayor prevalencia (3-6). Y es muy probable que haya una alta representación de infecciones mixtas entre estos dos virus, puesto que ambos son transmitidos por pulgón. En este sentido, las co-infecciones pueden estar favorecidas por diferentes factores. Por ejemplo, factores intrínsecos, como virus generalistas, la edad de la planta, o su estado nutricional, etc. Combinado con factores extrínsecos, como los modos de transmisión, los huéspedes alternativos, o las condiciones ambientales, pueden favorecer que diferentes virus coincidan espacio-temporalmente en una misma planta o cultivo. Es por ello por lo que la monitorización sistemática de las enfermedades víricas de las plantas es fundamental para conocer la epidemiología de sus poblaciones y comprender su dinámica evolutiva con el fin de facilitar el diseño de medidas de control eficaces y sostenibles.  Sin embargo, la falta de estudios epidemiológicos a largo plazo de las poblaciones víricas en estos cultivos deja sin conocer en profundidad las dinámicas eco-evolutivas de sus poblaciones.  En el equipo de trabajo, se vienen realizando prospecciones sistemáticas de las principales enfermedades virales en los cultivos del sureste, recogiendo material vegetal de diferentes cultivos, localidades y campañas. En este trabajo se examina dicho material para conocer el estado sanitario de los cultivos de melón y calabacín en el sureste español, además de caracterizar genéticamente las poblaciones de CABYV y WMV en dichos cultivos. 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Colección de muestras y detección de virus. Se recogió un total de 1608 muestras durante 2011-2020 en zonas productoras de melón y calabacín de Murcia, Alicante y C. La-Mancha. El ARN total de las muestras fue extraído con Tri-Reagent y mediante hibridación molecular por dot-blot usando sondas especificas se detectaron CABYV, WMV, ZYMV, CMV y PRSV.  2.2 Amplificación del genoma y secuenciación. Para realizar la secuenciación mediante PacBio se realizaron dos PCRs. Primero se hizo una RT-PCR con primers específicos de CABYV y WMV, que además llevaban unida una secuencia target. A continuación, en una segunda PCR se unen los barcodes para la secuenciación, antes del introducir las muestras al secuenciador, se hace una ligación de dos secuencias circulares (CLR) en los extremos de las secuencias, que aseguran la lectura continua de nuestros aislados. 2.3 Estudio filogenético y caracterización genética de CABYV y WMV. Se secuenciaron 24 aislados de CABYV y 22 aislados de WMV. El análisis filogenético se realizó con MEGA X y los eventos de recombinación se detectaron con RDP4. La diversidad genética de las poblaciones de CABYV y WMV se hizo con el programa DNASP6. Para estudiar si en las poblaciones se estaba produciendo una diferenciación temporal, utilizamos el programa TempEST. Los análisis de haplotipos y los análisis de varianza molecular (AMOVA) se realizaron en Rstudio. Las secuencias se depositaron en GenBank. 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN  11º Workshop en Investigación Agroalimentaria para jóvenes investigadores. Cartagena, 20 de junio 2022 47  En este trabajo se analizaron un total de 1608 muestras sintomáticas de melón y calabacín recogidas durante 10 temporadas (2011-2020). En general, CABYV fue el virus mayoritario (31%) tanto en melón como en calabacín, seguido de WMV (26%) (Fig. 1). Asimismo, observamos un alto número de infecciones mixtas, siendo mayoritaria la combinación de CABYV y WMV (10%), con una frecuencia desviada a lo esperada probabilísticamente. Esto sugería que las infecciones mixtas pueden tener un papel relevante en la epidemiología de ambas enfermedades.  Con la idea de profundizar en este aspecto, a continuación, se caracterizaron genéticamente las poblaciones de CABYV y WMV, agrupadas según el huésped, localización, campaña y tipo de infección (simple o mixta). Para esta caracterización se utilizó la tecnología de Pac-Bio, basada en la secuenciación a tiempo real de una sola molécula (SMRT) de ADN y cubriendo el genoma completo de cada aislado. Por un lado, el análisis filogenético mostró que los aislados de CABYV se agrupaban dentro del grupo Mediterráneo, excepto un aislado que estaba en el grupo de los recombinantes, y mostró un evento de recombinación en el ORF5. Por otro lado, los aislados de WMV se agrupaban principalmente en el grupo de emergentes, y dentro de estos observamos un aislado con un evento de recombinación en la P1. Además, también se observaron dos aislados clásicos.  El análisis de diferentes parámetros genéticos de las poblaciones de CABYV y WMV, no mostró ningún nivel de significancia para la diversidad nucleotídica, diferencia entre sustituciones sinónimas y no-sinónimas, flujo génico, D de Tajima, etc., dentro de las poblaciones. Sin embargo, el análisis de temporalidad filogenética mostró una señal temporal moderada de diferenciación dentro de cada población viral. Asimismo, el análisis de componentes principales discriminante (DAPC) corroboró dicha diferenciación temporal en los haplotipos dentro de las poblaciones. No obstante, mientras que la variación temporal en la población de WMV no dependía del tipo de infección según los análisis de varianza molecular (AMOVA), la variación encontrada en la población de CABYV fue significativamente dependiente del tiempo y el tipo de infección del que procedía cada aislado. Dicha variación atendiendo al tipo de infección fue confirmada con un análisis de componentes principales (PCA), donde observamos la separación entre las poblaciones de CABYV simple y mixta (Fig. 2).  4. CONCLUSIONES CABYV y WMV están entre los virus más prevalentes en los cultivos de melón y calabacín del sureste español.  La población de CABYV presenta una diferenciación temporal que puede ser explicada por el tipo de infección.  La población de WMV muestra una diferenciación temporal. Las infecciones mixtas son relevantes y pueden influir en la epidemiología de las enfermedades virales. 5. AGRADECIMIENTOS  Ministerio de ciencia, innovación y universidades con beca de doctorado (PRE2018-083915). AGL2017-89550-R de la Agencia Estatal de Investigación (AEI) y fondos FEDER (UE). 6. REFERENCIAS  1.  Alcaide C, Rabadán MP, Moreno-Pérez MG, Gómez P. Implications of mixed viral infections on plant disease ecology and evolution. In: Kielian M,  Mettenleiter TC, Roossinck MJ, editors. Advances in Virus Research. 2020. p. 145–69.  2.  Moreno AB, López-Moya JJ. When viruses play team sports: Mixed infections in plants. Phytopathology. 2020;110(1):29–48.  3.  Kassem MA, Sempere RN, Juárez M, Aranda MA, Truniger V. Cucurbit aphid-borne yellows virus is prevalent in field-grown cucurbit crops of southeastern Spain. Plant Dis [Internet]. 2007 Mar;91(3):232–8. Available from: http://apsjournals.apsnet.org/doi/10.1094/PDIS-91-3-0232 4.  Juarez M, Legua P, Mengual CM, Kassem MA, Sempere RN, Gómez P, et al. Relative incidence, spatial distribution and genetic diversity of cucurbit viruses in eastern Spain. Ann Appl Biol. 2013;162(3):362–70.  11º Workshop en Investigación Agroalimentaria para jóvenes investigadores. Cartagena, 20 de junio 2022 48  5.  Rabadán MP, Juárez M, De Moya-Ruiz C, Gómez P. Aphid-borne viruses infecting cultivated watermelon and squash in Spain: characterization of a variant of cucurbit aphid-borne yellow virus (CABYV). Plant Pathol J. 2021;(January):1–10.  6.  De Moya-Ruiz C, Rabadán P, Juárez M, Gómez P. Assessment of the current status of potyviruses in watermelon and pumpkin crops in spain: Epidemiological impact of cultivated plants and mixed infections. Plants. 2021;10(1):1–14.                   Figura 1. Virus transmitidos por pulgón (CABYV, WMV, ZYMV, CMV, MWMV, PRSV) detectados en melón y calabacín durante 2011-2020 en Murcia, Alicante y Castilla La-Mancha.             Figura 2. Análisis de componentes principales de las poblaciones de CABYV y WMV.   

Long-term monitoring and genetic dynamics of cucurbit  aphid-borne yellows virus and watermelon mosaic virus in  melon and zucchini crops

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