Introduction: Safe and effective delivery of short interfering RNA/short hairpin RNA (siRNA/shRNA) molecules for the purpose of RNA interference was one of the biggest challenges in the past 20 years. Transkingdom RNA interference (tkRNAi) was suggested as an alternative to the traditional delivery protocols. This work aimed to evaluate the efficiency and the potency of an improved bacterial delivery system in inhibiting human papilloma virus 16 (HPV16)-E7-specific mRNA in oral squamous cell carcinoma (OSCC).
Method and Results: Firstly, shRNA plasmids were constructed and transformed in the CEQ221 bacteria to construct the delivery vehicles. After bacterial transfection of the tumor cells, the ability of the modified bacteria to penetrate and collect in the tumor cells was confirmed by fluorescent microscopy. Efficiency of shRNA delivery and expression was confirmed by measuring the expression level of small siRNA and target gene mRNA via qRT-PCR; followed by a confirmation via western blot. Significant drop in the IC50 of the CEQ221-E7 targeting HPV16-E7 in oral squamous carcinoma cells as compared to their control counterparts CEQ221-GFP; and higher total apoptosis and activated caspase-3 activation confirmed the functional effect of the bacterial delivery-mediated inhibition of the HPV16-E7.
Conclusion: Transkingdom RNA interference is a potent tool to inhibit specific target genes in mammalian cells. It was proved for the first time that tkRNAi is capable of inhibiting HPV16-E7 gene in oral squamous cell carcinoma triggering apoptosis and lowering proliferation activity and eventually leading to target cell death.Sicherer und effektiver Transfer von Short-interfering-RNA-/Short-hairpin-RNA-Molekülen (siRNA/shRNA) zum Zweck der RNA-Interferenz war eine der größten Herausforderungen der vergangenen 20 Jahre. Als Alternative zu den herkömmlichen Transferprotokollen wurde eine Transkingdom-RNA-Interferenz (tkRNAi) vorgeschlagen. Die hier vorgestellte Arbeit hat die Effizienz und Wirksamkeit eines verbesserten Bakterien-Übertragungssystems zur Hemmung der humanpapillomvirus-16-(HPV16)-E7-spezifischen mRNA oraler Plattenepithelkarzinom-Zellen (oral squamous cell carcinoma , OSCC) untersucht.
Methodik und Ergebnisse: Zunächst wurden Plasmide konstruiert, welche neben einer therapeutischen shRNA zwei unterschiedliche Proteine kodieren. Das erste „Invasin“ verleiht nichtinvasiven, nichtpathogenen Bakterien einen invasiven Phänotyp. Das zweite Protein „Listeriolysin O“ zeigt sich dafür verantwortlich, dass die therapeutischen shRNA-Moleküle nach bakterieller Invasion in der Zielzelle freigesetzt werden. Nach bakterieller Transfektion der Tumorzellen, wurde die Fähigkeit der modifizierten Bakterien, in Tumorzellen einzudringen und sich dort zu sammeln mittels Fluoreszenzmikrokospie nachgewiesen. Die Effizienz des Transfers und der Expression der shRNA wurde durch die Messung des Expressionsniveaus von kleiner siRNA und der Zielgen-mRNA mit qRT-PCR bestimmt; bestätigt per Western-Blot. Ein signifikanter Abfall des IC50 von anti-HPV16-E7 CEQ221-E7 in oraler Plattenepithelkarzinom-Zellen im Vergleich zu CEQ221-GFP; und eine höhere Gesamtapoptose sowie eine aktivierte Caspase-3-Aktivierung bestätigten den funktionellen Effekt der durch die bakterielle Abgabe vermittelten Hemmung des HPV16-E7.
Schlussfolgerungen: Transkingdom-RNA-Interferenz ist ein wirksames Instrument zur Hemmung spezifischer Zielgene in Säugetierzellen. Es wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass tkRNAi das HPV16-E7-Gen beim oralen Plattenepithelkarzinom hemmen, Apoptose auslösen und die Proliferationsaktivität senken kann, was schließlich zum Tod von Zielzellen führt
