福岡大学博士（薬学）2022doctoral thesi

20372

イワオ, タクロウ

岩尾, 卓朗

Fukuoka University Repository / 福岡大学機関リポジトリ

氏 名 いわお たくろう 岩尾 卓朗 学 位 の 種 類 博士（薬学） 報 告 番 号 甲第 1990号 学位授与の日付 令和 5年 3 月 16日 学位授与の要件 学位規則第 4条第 2 項該当（論文博士） 学 位 論 文 題 目 Involvement of brain pericytes in age-related impairment of the Blood-Brain Barrier （加齢性血液脳関門機能障害における脳ペリサイトの関与） 論 文 審 査 委 員 （主 査） 福岡大学 教授 道具 伸也  （副 査） 福岡大学 教授 岩崎 克典   福岡大学 教授 山内 淳史   内 容 の 要 旨 【緒言】  加齢はアルツハイマー型認知症やパーキンソン病といった神経変性疾患の病態進展の主要な危険因子である。そして、これらの疾患は血液脳関門 (Blood-Brain Barrier; BBB)の破綻と密接に関連している。また、BBB 機能障害はアルツハイマー型認知症の発症に先行して出現し、認知機能低下のバイオマーカーとしての有用性が報告されている。更に、加齢に伴う BBB の破綻が神経変性疾患の病態形成に寄与するとの証拠が増えつつある。しかし、加齢に伴う BBB の破綻がどのようにして生じるかは明らかにされていない。  BBB は脳微小血管内皮細胞、アストロサイト及びペリサイトによって構成され、循環血中から脳への物質移行を制限することで中枢神経系の恒常性を維持している。中でも、脳微小血管内皮細胞間に発現する密着結合関連タンパク質 (Tight junction-associated proteins; Tjs)は、細胞間隙経路を介した物質移行を制限する上で主要な役割を担い、この Tjs の変性や消失は BBB バリア機能の破綻に寄与する。また、微小血管内皮細胞間に発現し組織構造の維持に必要な接着結合関連タンパク質 (Adherens junction-associated proteins; Ajs)は、Tjs 形成にも寄与している。更に、MFSD2A (Major facilitator superfamily domain-containing protein-2a)は脳微小血管内皮細胞の細胞膜に発現するドコサヘキサエン酸 (Docosahexaenoic acid; DHA)のトランスポーターとして機能するほか、エンドサイトーシスを制御することで経細胞経路を介した脳内への物質移行を抑制し、BBB バリア機能維持にも寄与している。  ペリサイトは脳毛細血管壁に沿って脳微小血管内皮細胞を取り囲むように存在する。ペリサイトは脳血管内皮細胞の Tjs 発現を誘導し、BBB バリア機能維持に寄与している。更に、ペリサイト非存在下では脳微小血管内皮細胞において MFSD2A が発現しないことが報告されており、ペリサイトは脳血管内皮細胞におけるエンドサイトーシスの制御及び DHA 輸送機能維持にとっても重要な役割を担う。  本研究では、加齢における老化ペリサイトの特徴的な変化に着目し、加齢に伴うBBB 機能障害におけるペリサイトの関与について検証した。  【第 1 章】 血液脳関門を介した DHAの脳移行は老齢 C57BL/6Jマウスにおいて減少する DHA は脳のリン脂質に豊富に存在する n-3経不飽和脂肪酸であり、脳神経機能の発達・維持において重要な役割を担う。しかし、脳内において DHA はほとんど合成されないため、脳内の DHA レベルを維持するためには BBB を介して脳内に輸送される必要がある。中でも、非エステル型 DHA (Non-esterified DHA; NE-DHA)は循環血中から脳への主要な供給源であることが報告されている。加齢に伴う脳内 DHA レベルの低下は認知機能の低下と関連しているが、なぜ加齢に伴い脳内 DHA レベルが低下するのかは不明である。また、加齢に伴い BBB バリア機能は脆弱化するが、DHA 輸送機能がどのように変化するかは明らかにされていない。そこで、2、8、12、24 カ月齢の雄性 C57BL/6J マウスを使用し、経心臓脳灌流法を用いて RI ラベル化された NE-DHA ([14C]DHA)の脳移行について検証した。その結果、NE-DHA の脳移行は 2 カ月齢マウスと比べ、12、24 カ月齢マウスにおいて減少することを明らかにした (図 1A)。更に、DHA トランスポーターである MFSD2A の脳微小血管における発現量は、12、24 カ月齢マウスの全脳における DHA 脳移行の低下と一致して減少し (図 1B)、MFSD2A 発現量の低下が DHA 脳移行の低下に寄与している可能性がある。  【第 2 章】 細胞老化を伴う血液脳関門の加齢性変動とミクログリア活性化との関連  近年、中枢における細胞老化が加齢性神経変性疾患の病態形成に寄与することが示唆されているが、BBB において細胞老化が生じるのかは不明確であり、脳微小血管で細胞老化が生じているのかin vivo において検証した。また、Tjs、Ajs 及びペリサイトの経時的変化と加齢に伴う BBB バリアの破綻が相関するのか確認した。更に、脳内炎症を惹き起こすことで神経変性疾患の病態形成に寄与するミクログリアの活性化と BBB バリア機能の破綻との関連について評価した。脳微小血管における Tjs 構成タンパク質である ZO-1、Ajs である cadherin 及びペリサイトマーカーである PDGFRβ は加齢に伴い減少が認められた。更に、細胞老化を特徴づける p53、p21、p16 発現量の加齢に伴う増加も認められた。また、ペリサイト細胞数は 2 カ月齢マウスと比較し 12 カ月齢マウスから大幅に減少しており (図 2)、MFSD2A 発現量の減少が加齢に伴うペリサイトの減少によるものであることを示唆している。血漿タンパク質であるフィブリノーゲンの脳内漏出は 24 カ月齢マウスにおいて確認され、それに付随してミクログリアの活性化が確認された (図 2)。これは、脳内に流入したフィブリノーゲンがミクログリア活性化に寄与していることを示唆するものである。加齢に伴うフィブリノーゲンの脳内漏出は、PDGFRβ 及び ZO-1 発現量が最も低レベルにあり、p16 発現量が最も高レベルにある状態で生じており、脳微小血管における細胞老化進行が BBB バリア機能にとって致命的な影響を与えることを示唆している。更に、加齢に伴う DHA 脳移行性の低下は BBB バリアの破綻に先行しており、脳内 DHA レベルの低下が BBBバリア機能障害に寄与している可能性がある。  【第 3 章】 ペリサイトの血液脳関門バリア機能増強作用は加齢によって減弱する  ペリサイトの細胞老化が BBB バリア機能に与える影響を検証するため、3 週齢 (若年)及び18 カ月齢 (老齢)の Wistar rat からペリサイトを単離し、脳血管内皮細胞のバリア機能に与える影響を in vitro において検証した。併せて、一般的に老化細胞を作製する手段として用いられる長期継代培養による複製老化と、老齢ラットから単離したペリサイトとの差異についても評価した。老齢ラット由来ペリサイト、及び複製老化によって細胞老化を誘発したペリサイトは BBB バリア機能強化作用が減弱した (図 3)。更に、これらの細胞は老化細胞の表現型を示し、老齢動物から単離したペリサイトは老化細胞の特徴を保持していることを示唆している。老齢ラットから単離したペリサイトの p21 発現量は変化しておらず、p16 発現量が増加していたことから、老齢マウスの脳微小血管における p16 発現量の増加には、脳ペリサイトの細胞老化が一部寄与している可能性が示された。  【第 4 章】 ペリサイトは PDGFB/PDGFFRβシグナルを介して脳血管内皮細胞におけるMFSD2A発現及び細胞膜局在を誘導する    ペリサイトが MFSD2A 発現に関与していることは報告されているが、どのように脳血管内皮細胞の MFSD2A 発現を制御するかは不明であり、本章ではペリサイトによる MFSD2A 発現制御機構について追及した。3 週齢の Wistar rat から単離した脳血管内皮細胞及びペリサイトを用いて共培養モデルを作製し、脳血管内皮細胞における MFSD2A 発現量及び細胞膜局在について検証した。ペリサイトは脳血管内皮細胞における MFSD2A 発現量及び細胞膜局在を増加させ、この結果はペリサイトの PDGFRβ をノックダウンすることにより打ち消された (図 4)。また、ペリサイトの培養上清では脳血管内皮細胞における MFSD2A 発現を誘導できなかったことから、ペリサイトは脳血管内皮細胞との PDGFB/PDGFRβ シグナルを介して MFSD2A の発現及び細胞膜局在を誘導していることが明らかになった。  【第 5 章】 DHA 摂取は加齢性血液脳関門障害及びミクログリア活性化を改善する  加齢に伴い脳内だけではなく脳微小血管内の DHA レベルが低下することが報告されているが、加齢に伴う BBB バリア機能の脆弱化と DHA との関係は不明である。そこで、DHA 摂取が加齢性 BBBバリア機能障害を改善しうるか、更に BBB バリア機能の改善が加齢性ミクログリア活性化の抑制に寄与しうるか検証した。19 カ月齢の C57BL/6J マウスに通常食(コントロール群)もしくはDHA 高含有食(DHA 群)を 13 週間摂食させ、脳微小血管における Tjs、Ajs、MFSD2A 発現量を評価した。更に、フィブリノーゲンの脳内漏出及びミクログリア活性化についても評価した。DHA 群はコントロール群と比較し ZO-1 及びMFSD2A 発現量が増加し (図 5)、フィブリノーゲンの脳内漏出を抑制した (図 6)。更に、DHA 摂取はミクログリア活性化も抑制した (図 6)。以上のことから、DHA は脳血管内皮細胞に作用することで加齢性 BBB バリア機能障害を改善し、フィブリノーゲンの脳内漏出を抑制することで、ミクログリア活性化を抑制する可能性がある。これは、加齢に伴う脳血管内皮細胞内の DHA レベルの低下が、BBB バリア機能の脆弱化、及びそれに付随するミクログリア活性化に寄与していることを示唆するものである。  【総括】  ペリサイトは若年、成人期において BBB バリア機能の強化及び脳血管内皮細胞における MFSD2A 発現を制御することで、BBB 機能維持に寄与している。しかし、中高齢期においてペリサイトが消失することで、脳血管内皮細胞における MFSD2A 発現量が減少し、DHA 脳移行が低下する可能性がある。脳内 DHA の半減期は長いため、この DHA 脳移行の低下は脳内 DHA レベルの低下に長期的に寄与すると考えられる。更に、脳ペリサイトの減少は ZO-1 発現量にも影響を及ぼすが、中高齢期においては BBB バリアが破綻するほどの影響はない可能性がある。老齢期において、ペリサイトの細胞老化及び脳血管内皮細胞内の DHA レベルの低下が BBB バリアの破綻を招き、血中から脳内へフィブリノーゲンが流入することで、二次的にミクログリアを活性化させることが示唆される。そして、ミクログリア活性化による脳内炎症は神経細胞を障害する。この障害の蓄積が加齢性神経変性疾患の病態進展に寄与する可能性がある。  以上、本研究結果は、老化したペリサイトの機能変化が、加齢性 BBB 機能障害を惹き起こすことを示唆する新たな知見を提供し、加齢性 BBB 機能障害の修復を指向した中枢神経変性疾患の新規予防戦略の構築に資するものである。   審査の結果の要旨  加齢はアルツハイマー型認知症やパーキンソン病といった加齢性神経変性疾患の病態進展の主要な危険因子である。これらの疾患は血液脳関門 (Blood-Brain Barrier; BBB)の破綻と密接に関連しており、実際、BBB 機能障害はアルツハイマー型認知症の発症に先行して出現し、認知機能低下のバイオマーカーとしての有用性が報告されている。更に、加齢に伴う BBB の破綻が神経変性疾患の病態形成に寄与するとの証拠が増えつつある。しかし、加齢に伴う BBB の破綻がどのようにして生じるかは明らかにされていない。  本研究では、加齢における老化ペリサイトの特徴的な変化に着目し、加齢に伴うBBB 機能障害におけるペリサイトの関与について検証した。  第 1 章では、血液脳関門を介したドコサヘキサエン酸（DHA）の脳移行が老齢C57BL/6J マウスにおいて減少することを明らかにした。DHA は脳のリン脂質に豊富に存在する n-3 経不飽和脂肪酸であり、脳神経機能の発達・維持において重要な役割を担う。しかし、脳内において DHA はほとんど合成されないため、脳内の DHA レベルを維持するためには BBB を介して脳内に輸送される必要がある。中でも、非エステル型 DHA (Non-esterified DHA; NE-DHA)は循環血中から脳への主要な供給源である。加齢に伴う脳内 DHA レベルの低下は認知機能の低下と関連しているが、なぜ加齢に伴い脳内 DHA レベルが低下するのかは不明であった。そこで、2、8、12、24 カ月齢の雄性 C57BL/6J マウスを使用し、経心臓脳灌流法を用いて RI ラベル化された NE-DHA ([14C]DHA)の脳移行について検証した。その結果、NE-DHA の脳移行は 2 カ月齢マウスと比べ、12、24 カ月齢マウスにおいて減少した。更に、DHA トランスポーターである MFSD2A の脳微小血管における発現量は、12、24 カ月齢マウスの全脳における DHA 脳移行の低下と一致して減少し、加齢に伴う MFSD2A 発現量の低下が DHA 脳移行の低下に寄与している可能性を明らかにした。  第 2 章では、BBB、すなわち脳微小血管で細胞老化が生じているのかを in vivo において検証した。脳微小血管における Tight junction 構成タンパク質である ZO-1、adherence junction である cadherin およびペリサイトマーカーである PDGFRβは加齢に伴い減少が認められた。更に、細胞老化を特徴づける p53、p21、p16 発現量の加齢に伴う増加も認められた。また、ペリサイト細胞数は 2 カ月齢マウスと比較し 12 カ月齢マウスから大幅に減少しており、血漿タンパク質であるフィブリノーゲンの脳内漏出は 24 カ月齢マウスにおいて確認され、それに付随してミクログリアの活性化が確認された。細胞老化を伴う血液脳関門の加齢性変動とミクログリア活性化との関連を明らかにした。  第 3章では、ペリサイトの細胞老化が BBB バリア機能に与える影響を検証するため、3 週齢 (若年)及び 18 カ月齢 (老齢)の Wistar rat からペリサイトを単離し、脳血管内皮細胞のバリア機能に与える影響を in vitro において検証した。老齢ラット由来ペリサイト、及び複製老化によって細胞老化を誘発したペリサイトは BBB バリア機能強化作用が減弱した。  第 4 章では、ペリサイトが MFSD2A 発現に関与していることは報告されているが、どのように脳血管内皮細胞の MFSD2A 発現を制御するかは不明であるため、ペリサイトによる MFSD2A 発現制御機構について追及した。ペリサイトは脳血管内皮細胞における MFSD2A 発現量及び細胞膜局在を増加させ、この結果はペリサイトのPDGFRβをノックダウンすることにより打ち消された (図 4)。また、ペリサイトの培養上清では脳血管内皮細胞における MFSD2A 発現を誘導できなかったことから、ペリサイトは脳血管内皮細胞との PDGFB/PDGFRβシグナルを介してMFSD2Aの発現及び細胞膜局在を誘導していることが明らかになった。したがって、加齢によるペリサイトの PDGFRβ発現量の減少による細胞間情報伝達の減弱が、MFSD2A 発現量減少を介して、BBB における DHA 輸送を低下させていることが示唆された。  第 5 章では、加齢に伴い脳内だけではなく脳微小血管内の DHA レベルが低下することが報告されているため、DHA 摂取が加齢性 BBB バリア機能障害を改善しうるか、更に BBB バリア機能の改善が加齢性ミクログリア活性化の抑制に寄与しうるか検証した。食餌により経口摂取した DHA は脳血管内皮細胞に作用することで加齢性 BBBバリア機能障害を改善し、フィブリノーゲン脳内漏出の抑制を介してミクログリア活性化を抑制する可能性を明らかにした。  以上、本申請論文は、老化したペリサイトの機能変化が、加齢性 BBB 機能障害を惹き起こすことを示唆する新たな知見を提供し、加齢性 BBB 機能障害の修復を指向した中枢神経変性疾患の新規予防戦略の構築に資するものであると高く評価できる。 また、公聴会審査における申請者の質疑応答は、学位を授与するに応分の能力を証明するものと結論した。  

Involvement of brain pericytes in age-related impairment of the Blood-Brain Barrier

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Involvement of brain pericytes in age-related impairment of the Blood-Brain Barrier

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