This work study the optimum conditions for the spcctrofotometric valoration of vitamine C wih 2-6-dichloro-indo-phenol. 
The selected method require a weak acidified medium and it based on 
the extraction of the excess of the reagent with n-butanol and the espectrophotometric determination of such excess measuring the absorbance at 520-540 
m¡. It permit the determination of vitamine e to concentrations included 
between o and 16 'Y per mI.Se estudia en este trabajo las condiciones óptimas para una valoración espectrofotométrica de vitamina con 2-6-dicloro-indo-fenoI. 
El método seleccionado requiere un pH ligeramente ácido, y está basado en la extracción del exceso de reactivo con l-butanol, y 
la determinación espectrofotométrica de este exceso midiendo la 
absorbancia a 520-540 mu. 
La técnica permite la determinación de concentraciones de vitamina c:; comprendidas entre O y 16 'Y por mI. 
Se nace un estudio del comportamiento de otras sustancias que 
habitualmente pueden acompañar al ácido ascórbico

Bosch, F.

Hernández, R.

Ars Pharmaceutica (Internet)

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Repositorio Institucional Universidad de Granada

DEPARTAMENTO DE BROMATOLOGIA, TOXICOLOGIA y ANALISIS QUIMICO APLICADO Prof. Dr. RAFAEL GARCIA V:XLLANOVA ES TUD IO ESPECTROFO T OME TRICO DE LA REACCI ON ENTRE LA VI TAMINA C y E L  2-6-D ICL ORO IND OFENO L por R. HERNANDEZ (+) y F. BOSCH SUMMARY This work' study the optimum conditions for the sp'cctrofotometric valo­ration of vitamine C wih 2-6-dichloro-indo-phenol. The selected method require a weak acidified medium and it based on the extraction of the excess of the reagent with n-butanol and the espectro­photometric determination of such excess measuring the absorbance at 520-540 m¡.t. H permit the determination of vitamine e to concentrations included between o and 16 'Y per mI. RESUMEN Se estudia en este trabajo las condiciones óptimas para una va­loración espectrofotométrica de vitamina Ccon 2-6-dicloro-indo-fenoI . El método seleccionado requiere un pH ligeramente ácido, y es­tá basado en la extracción del exceso de reactivo con l-butanol, y la determinación espectrofotométrica de este exceso midiendo la absorbancia a 520-540 mf.L. La técnicall'permite la determinación de concentraCiones de vi­tamina c:; comprendidas entre O y 16 'Y por mI. Se nace un estudio del comportamiento de otras sustancias que habitualmente pueden acompañar al ácido ascórbico. INTRODUCCION Son numerosos los métodos propuestos para la valoración de Vitamina C, prácticamente todos ellos basados en el poder reduc-An Pharmacéutica. Tomo xv Núm. Unico. 1974. 40 R. HERNAND.EZ y F. BOSCH tor de este compuesto. Los hay con técnicas volumétricas, cromato­gráficas, rara vez gravimétricas, pero sin duda los de mayor aplica­ción son los métodos colorimétricos. De los reactivos propuesto los 2-4-dinitrofenilhidrazina (1) (2), la 2-nitroanilina-diazoada (3) y el 2-6-dicloroindofenol (4), son sin duda los de más profunda aplica­ción, recientemente propusimos la n-bromosuccinimida (5), median­te la cual se consigue una determinación espectrofotométrica de vi­tamina e muy exacta, habiendo sido comprobado el método en di­versas formas farmacéuticas, sin embargo este último no es lo sufi­cientemente sensible para la determinación de muy pequeñas can­tidades de vitamina e, mayor sensibilidad posee el método que uti­liza como reactivo la 2,4-dinitrofenilhidrazina, pero las técnicas que lo usan resultan marcadamente complicadas. El 2-6-dicloroindofenol ha sido utilizado preferentemente en vo­lumetrías, no habiendo al parecer encontrado éxito las técnicas es­pectrofotométricas con este reactivo. Lo anteriormente expuesto nos hizo pensar en la conveniencia de la consecución de un método que a la vez fuera sensible, sencillo y suficientemente exacto para la determinación de la vitamina e, eligiendo el 2-6-dicloroindofenol, pues aunque a primera vista éste presentara el inconveniente de que su reacción con el ácido ascór­bico se manifiesta en una desaparición de color y no lo contrario como suele ser lo ideal, sin embargo su reacción con la vitamina e es bastante sensible y su empleo no requiere, salvo problemas muy complejos, procedimientos especiales. Pese a tratarse de un proceso redox la reacción es relativamente selecta debido a que el potencial normal redox del sistema o OH I! (X�� .. ,C� a a l e) I o �/ ) 1I N I'fI-4 © © � , Oe.l Ol:j ARS PHARMACEUTICA 41 es solo aproximadamente de 0,5 v .y por lo tanto solamente reduc­tores marcadamente enérgicos y cuya cinética de reacción sea favo­rable reaccionarán de forma análoga. No obstante en el caso de exis­tir en la disolución alguna sustancia de potencial suficientemente bajo, como puede ser el cloruro estamoso, aditivo autorizado y agre­gado en ocasiones a algunas conservas, o compuestos orgánicos con grupos -SR como el glutation, cualquier método directo es inade­cuado y se hace necesario para una exacta determinación la separa­ción previa de la vitamina C. PARTE EXPERIMENTAL l.-InfLuencia deL pH en La estabiLidad de la· diso,Lución de 2-6-diclo­Toindofenol Reactivos Disolución de 2-6-dicloroindofenol.-Prepárese extemporáneamente disolviendo 100 mg del producto RA. en 1 litro de agua destilada. Agua destilada Disolución 0,1 M de ácido clorhídrico Disolución 0,2 M de orto-fosfórico Disolución al 2% de metafosfórico Disolución 1 M de ácido acético Disolución reguladora 1,6 M de ácido acético - 1,2 M de acetato só­dico. Disolución 0,1 M de hidróxido 8ódico Técnica A 5 mI de la disolución del colorante se le odicionan 0,5-1-2 y 5 mI de la disolución ácida o alcalina relacionadas en el apartado de reactivos, leyendo la absorbancia de todas las disoluciones a los 10, 20 y 30 minutos. Los resultados obtenidos a 500 mfL fueron los si­guientes: 42 R. HERNAND.EZ y F. BOSCH TABLA 1 mI de Ac . clorhídrico 0,1 N 0,5 1,0 2,0 5,0 D. O .  10 minutos 1 0,54 0,26 0,06 20 0,65 0,245 0,09 0,03 30 " 0,395 0,125 0,05 0,01 TABLA II mI de ac. ortofosfórico 0,2 N 0,5 1,0 2,0 5,0 10 minutos 0,14 0,08 0,06 0,04 20 " 0,08 0,06 0,05 0,03 30 " TABLA III mI de ac. metafosfórico 2% 0,5 1,0 2,0 5,0 10 minutos 1,7 1,0 0,64 0,26 20 " 1,0 0,7 0,38 0,13 30 " 0,9 0,52 0,25 0,07 TABLA IV mI de ácido acético 1 M 0,5 5,0 10 minutos 1,9 0,82 20 " 1,85 0,68 30 " 1,8 0,56 TABLA V mI de tampón acéticoacetato .. 0,5 1,0 2,0 5,0 10 minutos 2,0 2,0 1,8 1.1 20 " 2,0 2,0 1,9 1,1 30 " 2,0 1,95 1,8 1,0 mI de NaOH 0,1 N . . .  10 minutos 20 " 30 " i\RS PHi\RMACEUTICA TABLA VI 0,5 1,70 1,70 1,68 1,0 1,60 1,60 1,60 2,0 5,0 43 1,20 0,75 1,19 0,75 1,19 0,74 2.-Influencia del tiempo en la reacción entre 2,6-dicloroindofenol y la vitamina C. Reactivos Disolución "madre" de 2-6-dicloroindofenol. Se disuelven 100 mg del producto R. A. en 500 mI de agua destilada. Disolución diluida de 2-6-dicloroindofenol. Diluir extemporaneamen­te al 207& la disolución anterior. Disolución de vitamina e conteniendo 20 mgjlitro. Disolución reguladora de ácido acético 1,6 M. -Acetato sódico 1,2 M. Técnica Se colocan 0,5, 2 Y 5 mI de la disolución' de vitamina e en sen­dos tubos de ensayo, se completa con agua destilada a 5 mI, se agre­ga 2 mI de disolución reguladora y seguidamente 5 mI de la disolu­cióndiluida del colorante. Las absorbancias a 530 m¡;, fueron las si­guientes: Tiempo transcurrido 6 minutos 15 25 60 " " " 2 j mI Vito e 0,420 0,410 0,420 0,420 8 j mI 20/ml Vit. e Vit. e 0,155 O 0,160 O 0,160 O 0,155 O 44 R. HERNAND·;CZ y F. BOSCH 3.-Extracción con disolventes o rgánicos del exceso de 2-6-dicloro­indofenol Reactivos Disolución "madre" de 2-6-dicloroindofenol. Disuélvase 100 mg del producto R. A. en 500 mI de agua destilada . Disolución diluida de 2-6-dicloroindofenol.-Dilúyase extemporánea-mente al 20% la anterior. Disolución HCH3C OO 1,6 M - NaCH,C O O  1,2 M n-butanol Isobutanol n-amílico Isoamílico Cloroformo Tetracloniro de carbono Eter de petróleo Xileno Técnica A 5 mI de disolución conteniendo 8 ppm de vitamina C se le agrega 2 mI de tampon y seguidamente 5 mI de la disolución dilui­da de 2-6-dicloroindofenol. �e aguarda 10 minutos y seguidamente se extrae con 5 mI del respectivo disolvente. Finalmente se lee la absorbancia de la capa orgánica entre 360-600 mfJ-. Resultados No se incluyen los valores obtenidos por el gran espacio que ello supondría. Con todos los disolventes a excepción del éter de pe­tróleo se conseguía una extracción cuantitativa del exceso de 2-6-dicloroindofenol. En los disolventes no alcohólicos (cloroformo, xileno . .. ) la sen­sibilidad es algo inferior a la del n-butanol y los restantes alcoho­les, presentando un máximo a 460-490 mIL, Y en el caso de los disol­ventes alcohólicos la misma absorción tiene lugar a 530-550 mfJ-. Considerando que la proporcionalidad del descenso de D. O. con la concentración de vitamina C, se sigue de forma análoga en casi ARS PHARMACEUTICA 45 todos los disolventes, la elección del n-butanol para el resto de las experiencias no excluye la posibilidad de empleo de alguno de los otros alcoholes ensayados. 4.-Método patrón seleccionado Reactivos Los mismos que en el ensayo 2 y n-butanol. Técnica. A partir de la disolución patrón de 20 mg de vitamina e pre­parar una escala que contenga de O a 16 ppm, completar después a 5 mI con Agua destilada, agregar a continuación 2 mI de disolución acético-acetato y seguidamente 5 mI de disolución diluida de 2-6-di­cloroindofenol, aguardar 5-10 minutos y agregar 5 mI de n-butanol, agitar fuertemente y dejar repos3.r, sep:lrar la capa de n-butano1, filtrar y efectuar la lectura espectrofotométrica a 530 m¡.t. 5.-Influencia de otras sustancias Se colocan en todos los tubos 2 mI de la disolución de 20 ppm de vitamina e y a continuación la concentración del ión o molécula señalados en la Tabla, se completa a 5 mI y se prosigue como se señala en el apartado 4. (La D. O. correspondiente a 8 ppm. de vi­tamina e es 0,54. 46 R. HERNAND.EZ y F. BoseH 1'20 roo 0'8 o D.o. 0'2 o , 2 6 8 10 12 ARS PHARMACEUTICA 47 ION O MOLECULA 'PPM D. O. CI- 6.000 0,54 CI- 36.000 0,57 HCOa 4.000 0,54 HC03 20.000 0,58 S024 4.000 0,54 S024 24.000 0,53 NO-3 7.500 0,54 NO-a 45.000 0,53 P03.¡- 2.000 0,54 P034- 10.000 0,52 Na+ 5.000 0,54 Na+ 30.000 0,53 K+ 5.000 0,54 K+ 30.000 0,50 Ca2+ 2.000 0,54 Ca2+ 12.000 0,53 Mg2+ 1.000 0,54 Fe3+ 30 0,98 Fe3+ 300 1,08 Glucosa 10.000 0,55 Glucosa 60.000 0,45 Sacarosa 10.000 0,55 . Sacarosa 60.000 0,54 Lactosa 10.000 0,53 Lactosa 60.000 0,54 Vitamina B, 100 0,55 Vitamina B1 600 0,55 Vitamina B6 100 0,55 Vitamina B, 600 0,53 48 R. HERNAND·:::Z y F. BOSCH DISCUSION De los ensayos verificados con la finalidad de deducir la esta­bilidad del reactivo en relación al pH, se puede comprobar como ésta disminuyó considerablemente a medida que lo hace el pH. En ácido acético 1 M, la inestabilidad es todavía apreciable espectro­fotométricamente. Solo la disolución reguladora de ácido acético 1,6 M, o sea a pH aproximadamente 4,6, la estabilidad se puede consi­derar mis que suficiente desde un punto de vista analítico. Los re­sultados obtenidos por nosotros están en perfecta consonancia con los logn,dos por Isamu Tachi y Shinji Koide (7), mediante técnicas potenciométricas y polarográficas, en su trabajo estos auto:es llegan a la conclusión de que el pH óptimo para el 2-6-dicloroindofenol es de 4 a 6, por debajo de pH 3,5 el compuesto se descompone rápida­mente, por encima de 7 la oxidación tanto del ácido ascórbico co­mo del 2-6-dicloroindofenol es muy rápida. La Tabla correspondiente al ensayo, de la influencia del tiempo en la reacción entre el 2-6-dicloroindofenol y la vitamina C, refle­jan que la reacción es relativamente rápida y que el producto de reacción es marcadamente estable en las condiciones ensayadas. Se ha estudiado el comportamiento de cierto número de sustan­cias que frecuentemente acompoñan a la vitamina C en los proble­mas habituales. Es de resaltar la no interferencia de la�l·:vit'aminas Bl y B6, a concentraciones 100 veces superior, así como las de saca­rosa, lactosa y la mayoría de los iones más frecuentes a concentra­ción incluso 10.000 veces superior; la glucosa interfiere ligeramente. El Fe (IH) es una interferencia importante, debido sin duda a su carácter ligeramente oxidante . ARS PHARMACEUTlCA BIBLIOGRAFIA (1) J. M. ROE Y C. A. KUETHER.-SCience, 95,77 (1942). (2) J. M. ROE Y C. A. KUETH.ER.-J. Biol. Chem.� 147,399 (1943). (3) H. MOHR. Mit. Gebiete. Lebensmittelunters. Hyg. 47, 2Q ( 1956). (4) J. TILLMANS .-T. Unters. Lebensmitted, 54, 33 '(1927). (5) F. BOSCH. Ars. Pharm., 11, 267, (1970). 49 (6) R. STROHECKER, W. HEIMAN y F. MATT.-T. Analyt. Chem. 145, 401 ( 1955). (7) 1. TACH I y S .  KmDE . . J. Agr. Chem. S oco Japan 25. 1'45-9 ( 1951). 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Estudio espectrofotométrico de la reacción entre la vitamina C y el 2-6-dicloroindofenol

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