Dissertação de mestrado em BiotechnologyAs infecções das vias respiratórias inferiores (IVRI) são uma causa comum de mortalidade/morbilidade
em todo o mundo. As IVRI são frequentemente governadas por biofilmes, tipicamente polimicrobianos e
na sua maioria dominadas por espécies bacterianas Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,
Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae), mas também por fungos (por exemplo, Candida
albicans). Os biofilmes contribuem significativamente para o aparecimento de resistência antimicrobiana
(RAM), o que é de grande preocupação clínica. A ineficácia dos antibióticos e a falta de novos antibióticos
exige fortemente estratégias alternativas que possam restabelecer a acção dos antibióticos existentes
contra os agentes patogénicos. O principal objectivo deste trabalho foi o de encontrar estratégias
combinatórias eficazes de antibiótico-adjuvante capazes de atenuar os traços de RAM nos agentes
patogénicos associados ao IVRI, isolados e em co-infecção.
Em primeiro lugar, a susceptibilidade das populações microbianas foi avaliada em relação a um painel
de compostos, incluindo antibióticos e potenciais compostos adjuvantes (PCAs). Os antibióticos
ineficazes foram testados em combinação com todos os PCAs e verificados quanto à sinergia através de
um checkboard assay. As combinações antibiótico-adjuvante mais promissoras foram então empregadas
contra biofilmes pré-estabelecidos 24 h de uma única espécie, de dupla (P. aeruginosa/S. aureus) e
tripla espécie (P. aeruginosa/S. aureus/K. pneumoniae) para avaliar a sua eficácia.
A maioria das populações microbianas mostrou resistência à maioria dos antibióticos (12 em 25). Não
foi encontrada actividade antimicrobiana para os 4 AAE testados (EDTA, SucA, FAR, LIN). Foram
encontradas combinações sinergéticas contra S. aureus, K. pneumoniae e A. baumannii, conforme
determinado pelo índice FIC. EDTA e LIN mostraram os melhores resultados ao interagirem com sucesso
com todos os antibióticos que anteriormente tinham sido considerados ineficazes. As combinações
antibiótico-adjuvante de PIP+EDTA, PIP+COL, COL+EDTA, e COL+LIN foram testadas contra biofilmes de
uma e várias espécies. Todas as combinações testadas levaram a reduções significativas na biomassa
do biofilme de P. aeruginosa e S. aureus; reduções igualmente visíveis no número de células foram
também obtidas nos biofilmes formados por cada espécie. No entanto, não foi observada qualquer
redução significativa na massa do biofilme de K. pneumoniae e A. baumannii, mas houve uma diminuição
nas células cultiváveis. As combinações antibiótico-adjuvantes contra biofilmes de dupla espécie
resultaram em reduções significativas na biomassa do biofilme e nas células cultiváveis de P. aeruginosa.
Quanto aos biofilmes tri-espécies, a única redução significativa na massa dos biofilmes foi encontrada quando foram utilizadas combinações de COL. Contudo, nenhuma combinação foi capaz de erradicar
completamente as populações de biofilmes.Lower respiratory tract infections (LRTIs) are a common cause of mortality/morbidity worldwide. Biofilms
often govern LRTIs, typically polymicrobial and dominated mainly by bacterial species Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae), but also fungi
(e.g., Candida albicans). Biofilms contribute significantly to the emergence of antimicrobial resistance
(AMR), which is of great clinical concern. The antibiotic ineffectiveness and the lack of new antibiotics
strongly demand alternative strategies that may restore the action of existing antibiotics against
pathogens. The main goal of this work was to find effective antibiotic-adjuvant combinatorial strategies
able to attenuate AMR traits in LRTI-associated pathogens, isolated and in co-infection.
Firstly, the susceptibility of the microbial populations was evaluated against a panel of compounds,
including antibiotics and potential adjuvant compounds (AAEs). Ineffective antibiotics were tested in
combination with all the AAEs and checked for synergy through a checkerboard assay. The most
promising antibiotic-adjuvant combinations were then employed against 24 h pre-established biofilms of
single species and of dual (P. aeruginosa/S. aureus) and triple-species (P. aeruginosa/S. aureus/K.
pneumoniae) to evaluate their effectiveness.
Most microbial populations showed resistance to most antibiotics (12 out of 25). No antimicrobial activity
was found for the 4 tested AAEs (EDTA, SucA, FAR, LIN). Synergistic combinations were found against S.
aureus, K. pneumoniae, and A. baumannii, as determined by the FIC index. EDTA and LIN showed the
best outcomes by successfully interacting with all antibiotics previously found ineffective. Antibiotic adjuvant combinations of PIP+EDTA, PIP+COL, COL+EDTA, and COL+LIN were tested against single and
multi-species biofilms. All tested combinations led to significant reductions in the biofilm biomass of P.
aeruginosa and S. aureus; similarly visible reductions in the number of cells were also obtained in the
biofilms formed by each species. However, no significant reduction in the biofilm mass of K. pneumoniae
and A. baumannii were observed, but there was a decrease in cultivable cells. The antibiotic-adjuvants
combinations against dual-species biofilms resulted in significant reductions in biofilm biomass and
cultivable cells of P. aeruginosa. As for triple-species biofilms, the only significant reduction in biofilm
mass was found when COL combinations were employed. However, no combination was able to eradicate
biofilm populations
